Summary
Недорогие, высокая пропускная способность метода для одновременного обнаружения до 43 молекулярных мишеней описано. Применение mPCR / RLB включают набрав микробного и обнаружение нескольких возбудителей из клинических образцов.
Abstract
Мультиплекс ПЦР / Обратная линия блот гибридизация анализа позволяет обнаруживать до 43 молекулярных мишеней в 43 образцах с помощью одной мультиплексной ПЦР реакции следуют зонда гибридизации на нейлоновую мембрану, которая повторного использования. Зонды 5 'амин изменена, чтобы фиксации мембраны. Грунтовки 5 'биотин изменение, которое позволяет обнаружения гибридизированных продуктов ПЦР с использованием стрептавидин-пероксидазы и хемилюминесцентный субстрат с помощью светочувствительной пленке. При низкой установки и затраты на расходные материалы, эта технология является недорогой (около 2 долл. США в выборке), высокая пропускная способность (несколько мембраны могут быть обработаны одновременно) и короткие сроки выполнения работ (около 10 часов).
Метод может быть использован в ряде направлений. Несколько зонды могут быть предназначены для обнаружения последовательности изменения в пределах одного усиленный продукт, или несколько продуктов могут быть усилены одновременно, с одним (или более) зонды используются для последующего обнаружения. Сочетание обоих подходов также может быть использован в рамках одного теста. Возможность включать несколько зондов для одной последовательности целевой делает анализ весьма специфичны.
Опубликованные приложения mPCR / RLB обнаружения включают антибиотик 1,2 генов устойчивости, введя метициллин-резистентный золотистый стафилококк 3-5 и Salmonella SP 6, молекулярной серотипирование Пневмококк 7,8, Streptococcus agalactiae 9 и энтеровирусы 10,11, идентификация микобактерий SP 12, выявление половых 13-15 и дыхательных путей 16 и 17 другими патогенами и обнаружения и идентификации mollicutes 18. Тем не менее, универсальность средств технического применения практически безграничны и не ограничивается молекулярного анализа микроорганизмов.
Пять шагов в mPCR / RLB являются: а) Primer и зонда дизайн, б) выделения ДНК и ПЦР-амплификации с) подготовка мембраны, г) Гибридизация и обнаружения, и д) Регенерация мембраны.
Protocol
Особое внимание должно быть уделено грунтовки и зонда дизайна. Все имеющиеся последовательности целей представляют интерес с базами данных, такими как GenBank должны быть использованы для идентификации сохраняется областях, которые являются подходящими целями. Если большое количество целей в настоящее время усиливаются в одном анализе mPCR, каждый усиливается последовательность должна быть такой же длины, и не должна превышать 300 пар оснований, чтобы избежать конкуренции. Альтернативного применения метода для усиления один больше целевых использованием праймеров против сохраняется регионах и использовать несколько зондов для определения последовательности изменения в ампликона. В этом случае усиливается ПЦР продукт может быть больше. Грунтовка температурах отжига все должны быть похожи, с условиями ПЦР соответствующим образом скорректированы. Грунтовки, которые образуют сильный вторичной структуры или праймер димера следует избегать. Sigma Aldrich ДНК калькулятор ( http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp ) можно использовать для надежного прогнозирования этих особенностей.
ДНК-зонды должны быть рассчитаны на отжиг температурах, близких к 60 ° С. Для обеспечения максимальной специфичности, два зонда для каждой целевой интересов могут быть включены в анализ, один гибридизации вперед нити ДНК, прилегающих к обратный праймер сайт связывания, а другой обратном нить рядом с прямого праймера сайт связывания. В данном случае, прямого и обратного праймеров должны быть биотин-изменены. Если только один зонд на усиленный цели используется, то только одна грунтовка необходимости биотин изменены.
При проектировании праймеров и зондов для mPCR / RLB анализа, настоятельно рекомендуется использовать в методах кремний предсказать продукты ПЦР и гибридизации зонда, коррелируют с результатами в пробирке. В идеале это делается с использованием штаммов, для которых вся последовательность генома доступна. Программное обеспечение таких как FastPCR (продается в http://primerdigital.com/fastpcr.html) могут быть использованы для этой цели. Слабый или отсутствующий датчик сигнала может быть предсказано, где в анализе кремний указывает пар оснований несоответствия приводит к снижению датчик температуры отжига.
Методы выделения ДНК будет варьироваться в зависимости от образцы проходят испытания, и ПЦР условиях будет зависеть от грунтовки дизайна. Читатели могут обратиться к публикациям на отдельные тесты для получения дополнительной информации относительно выделения ДНК и ПЦР реагентов и условий 1-19.
Каждое определение запускается с соответствующим контролем, чтобы обеспечить по крайней мере одно положительное и одно отрицательное сигнала датчика для каждого датчика на мембрану, а также ДНК-свободный контроля. Кроме того, это полезно включить датчик в верхней части мембраны, как ожидается, будет положительным для всех образцов (например, вида или рода конкретных зонда в случае микроорганизмов). Это служит положительный контрольный датчик, но и позволяет легко ориентироваться на результаты.
1. Подготовка Мембранные
- Подготовьте следующие решения:
- 100 мл 0,5 М NaHCO 3 (рН 8,4)
- 100 мл 0,5 М NaHCO 3
- 20 мл 16% EDAC
- 250 мл 0,1 М NaOH
- 250 мл 2xSSPE
- 250 мл 2xSSPE/0.1% SDS - место в водяной бане при температуре 60 ° C
- 250 мл 20 мМ ЭДТА.
- Разогреть духовку до 60 ° C.
- Чистая Immunetics Miniblotter с 70% этанола.
- Развести олигонуклеотидных зондов в 0,5 М NaHCO 3 до конечной концентрации 2 пмоль / мкл и объеме 200 мкл.
- Вырезать BiodyneC мембрана нейлона для 15x15 см. Использование карандаша и линейки, правила от 0,5 см пространства на территории верхней части мембраны и писать подробности здесь.
- Уплотнение мембраны в полиэтиленовый пакет с 20 мл свежеприготовленного 16%-ный раствор EDAC и рок-при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Вымойте мембраны в деионизированной воде в течение 30 секунд.
- Место мембраны в miniblotter с каналами работающий через мембрану (параллельно карандашом линию). Положите подушку поддержку на месте и близко промокашки. Аспирацию жидкости из каналов.
- Заполните дорожки 1 и 45 с 150 мкл 0,5 М NaHCO 3. Используйте 150 мкл каждой пробы решение для заполнения полосы 2-44 последовательно, соблюдая осторожность, чтобы избежать воздушных пузырей. Если пузырек воздуха действительно кажется, в канале, держа пипетку на месте, быстро аспирата решение, позволяющее воздушный пузырь плавать в начало пипетки, а затем повторите попытку. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Аспирируйте зонд решения, удалите мембраны и промыть в 250 мл 0,1 М NaOH при комнатной температуре в течение 9 минут.
- Вымойте мембраны в 250 мл 2xSSPE течение 30 секунд.
- Вымойте мембраны в 250 мл подогретого 2xSSPE/0.1% SDS в духовке при температуре 60 ° С в течение 5 минут.
- Если не используется для гибридизации сразу же, мыть мембраны в 240 мл 20 мМ ЭДТА при комнатной температуре в течение 20 минут (резервирование оставшиеся 10 мл), то уплотнение мембраны в полиэтиленовом пакете с остальными 10 мл 20 мМ ЭДТА и хранениеме в холодильнике при температуре 4 ° C.
- Вымойте miniblotter с Pyroneg моющего средства и щетки. Промойте и дайте высохнуть.
2. Гибридизация и обнаружение
- Подготовьте следующие решения:
- 250 мл 2xSSPE/0.1% SDS - хранить на водяной бане при температуре 60 ° C.
- 500 мл 2xSSPE/0.5% SDS - хранить на водяной бане при 60 ° C
- 500 мл 2xSSPE/0.5% SDS - магазин в духовке при температуре 42 ° C
- 500 мл 2xSSPE - держать при комнатной температуре
- 500 мл 1% SDS - хранить на водяной бане при 60 ° C вначале (для шага 3)
- 250 мл 20 мМ ЭДТА - хранить при комнатной температуре (для шага 3).
- Включите одной печи при температуре 60 ° С и одной печи до 42 ° C. Доведите воду до кипения в большой стакан на плите.
- Чистая Immunetics Miniblotter с 70% этанола.
- Алиготе 10 мл 2xSSPE/0.1% SDS в маленький контейнер. Добавьте 20 мкл каждого продукта ПЦР до 150 мкл 2xSSPE/0.1% SDS в трубах сочтены.
- Варить продукты ПЦР в течение 10 мин при температуре 100 ° С с использованием пенополистирола владельцев. Место на лед сразу, по крайней мере 5 минут.
- Вымойте мембраны в оставшиеся 240 мл 2xSSPE/0.1% SDS в 60 ° С духовке в течение 5 минут.
- Место мембраны в miniblotter при поддержке подушке. Ориентироваться таким каналам работать вертикально (перпендикулярно карандашом линию).
- Всасывающая лишнюю жидкость из miniblotter каналов.
- Добавить оставшиеся 150 мкл 2xSSPE/0.1% SDS для первого и последнего каналов. Добавить вареных продуктов ПЦР для остальных каналов (2-44) в последовательности, соблюдая осторожность, чтобы избежать воздушных пузырей.
- Место miniblotter квартиру в 60 ° С духовке в течение 1 часа, чтобы гибридизация иметь место.
- Аспирацию жидкости из каждого канала затем удалить мембрану из miniblotter.
- Мыть два раза в 250 мл нагретого 2xSSPE/0.5% SDS в 60 ° С духовке в течение 10 минут.
- Смочите нейлоновой сетки с разделяющей 2xSSPE/0.5% SDS при 42 ° С и использовать его для закатать мембраны.
- Место засучив мембрану в роликах трубы, и развернуть для обеспечения мембраны примыкает к внутренней поверхности. Добавить 3 мкл стрептавидин-пероксидазы сопряженным (Roche Applied Science) по 15 мл 2xSSPE/0.5% SDS при 42 ° С и добавить ролик трубки. Винтовая крышка крепко и инкубировать в роликовых духовке при температуре 42 ° С в течение 60 минут. Обеспечить направление рулон так, что мембрана не затянуть. Периодически проверяйте на наличие утечек.
- Вымойте miniblotter в Pyroneg моющее средство и воду, промыть и дать высохнуть.
- Удалить мембрану из ролика трубки. Мыть два раза в остальных 2xSSPE/0.5% SDS при 42 ° С в течение 10 минут.
- Мыть два раза в 2xSSPE при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Включите духовку до 80 ° C и место 500 мл 1% SDS в духовке предварительно тепло.
- Макияж 15 мл Amersham ECL обнаружения решение (7,5 мл раствора и 7,5 мл раствора Б). Отменить 2xSSPE и добавить обнаружения решение. Рок аккуратно вручную в течение 2 минут обеспечение всеобщего охвата мембраны с решением. Отменить хемилюминесцентный решение.
- Отрежьте два листа пластиковых прозрачности, чтобы соответствовать экспозиции картриджа. Место мембрану между двумя листами и место в экспозиции картриджа.
- Приступить к темной комнате. Под красным светом, добавить ECL фильм обнаружения картриджа и выставить на 5 минут. Собака-уха правом нижнем углу фильма при удалении, чтобы правильную ориентацию при просмотре.
- Разработка фильм с автоматизированной разработчик или химических ванн как направления на производителя.
- Повторите экспозиции с более или менее продолжительного времени экспозиции, если требуется.
3. Регенерация Мембранные
- Вымойте мембраны в 250 мл 1% SDS при 80 ° С в течение 30 минут два раза.
- Вымойте мембраны в 240 мл 20 мМ ЭДТА при комнатной температуре в течение 15 минут.
- Уплотнение мембраны в полиэтиленовый пакет с 10 мл 20 мМ ЭДТА и поставить в холодильник при температуре 4 ° С для будущего повторного использования.
4. Представитель Результаты:
Результаты лучше всего рассматривать, помещая пленку на печатной сетки, иначе сканирования изображения и импорта в такие программы, как BioNumerics (Прикладная математика, Sint-Martens-Latem, Бельгия). Каждый зонд результат следует интерпретировать с учетом положительных и отрицательных зондов контроля. Результаты лучших оценивались как отрицательные, слабые или положительным. Положительные результаты, где сигнал сильнее, или сильнее, чем положительный контрольный датчик. Отрицательные результаты находятся там, где сигнал отсутствует или равно отрицательного контроля (в случае фонового сигнала). Слабые результаты, где сигнал слабее, чем положительный контрольный датчик, но сильнее, чем отрицательный контроль. Слабые результаты могут быть результатом точечных мутаций, приводящих к слабой связи зонда, или из-за неспецифических сигналов от грунтовки образование димера. С помощью двух зондов в целевой интерес может повысить специфичность, где один слабый результат можно смело интерпретировать как неспецифический сигнал. Если какие-либо сомнения остается, одной сложной ПЦР-реакции могут быть выполнены с на основе геля обнаружения и последовательности любых усилителейlified продукта, чтобы определить, результат действительно положительный. Представитель Результат показан на рисунке 2.
Рисунок 1. MPCR / RLB принципов (P1) Шаг 1.9. Амин изменение зондов связаны ковалентно нейлоновые мембраны. (P2) Шаг 2.10. Биотин изменение ПЦР продукты гибридизации с зондами. (P3) Шаг 2.14. Стрептавидином, меченные пероксидазой, инкубируют с мембраной и связывается с биотином. (P4) Шаги 2.19-2.21. Пероксидаза катализирует реакцию в ECL реагенты обнаружения, производя свет которых светочувствительным фильма подвергается. Мембрана затем промывают для повторного использования.
Рисунок 2. Представителю mPCR / RLB результат. Образцы с 1 по 6 представляют положительного контроля - между ними есть хотя бы один положительный сигнал датчика для каждой из 43 проб. Каждый целевой последовательности (через U) обнаружен с двумя разными зондами максимально специфику. Зонды А1 и А2 представляют видоспецифические зондов, которые, как ожидается, будет положительным для каждого образца и помощь в ориентации пленки. Зонд A1 повторяется в нижней части мембраны. Образцы 7 и 8 отрицательных контролей. Обратите внимание, что зонды Q1, Q2, T1 и T2 есть сигнал в отрицательных контролей, что указывает на вероятность неспецифического связывания праймеров или продукта грунтовки димера. Редизайн эти зонды или праймеры не потребуется. Зонды C1, D1 и F1 шоу полос через мембрану вероятно, из-за некоторых неспецифических поглощение стрептавидин-пероксидазы сопряженным или хемилюминесцентный субстрат, однако это легко отличить от настоящих позитивных сигналов зонда. Зонды D1 и D2 имеют относительно слабый сигнал по сравнению с другими датчиками, это может быть связано с более крупными ампликонов приводит к менее эффективным усиления. Зонд J2 отрицательное в несколько образцов (1, 3, 4, 6, 39), где зонд J1 является положительным. Это, скорее всего, представляет собой мутацию в J2 сайт связывания для этих образцов.
Discussion
MPCR / RLB метод позволяет одновременное обнаружение большого количества ампликонов ПЦР. Из-за высокой чувствительности хемилюминесцентный зонд основе обнаружения, одной мультиплексной ПЦР реакция с большим количеством пар праймеров могут быть использованы для усиления ДНК.
Если ни один датчик сигналов, полученных с одного или нескольких образцов, проведение гель-электрофореза с любой оставшийся продукт ПЦР может помочь отличить, является ли проблема с ПЦР-амплификации или зонда гибридизации. Там, где все сигналы датчика на мембране являются слабыми или отсутствуют, но гель-электрофореза указывает на успешное ПЦР-амплификации, возможности включают проблемы с маркировки мембрану, неправильной регенерации мембран после предыдущего использования, неправильной температуре во время инкубации гибридизации или стрептавидин, или дефектные стрептавидином сопряженных пероксидазы или обнаружения реагента.
Если контрольные пробы показывают, что отдельные зонды может производить ложные отрицательные сигналы, один ПЦР с гелем основе выявления и последующего секвенирования могут быть выполнены, чтобы проверить усиления ПЦР-продукт и искать последовательность изменения в сайт связывания зонда. Слабый или отсутствующий датчик сигнала может быть связано с большим размером ампликона: если возможно все ампликонов должна быть такой же длины и менее 300 бп. Вторичные структуры ДНК ампликонов также может привести к плохой обязательным зонд и может привести к ре-дизайн праймеров. Индивидуальные грунтовки или зонд концентрации могут также быть изменены для оптимизации сигнала.
Ложные положительные сигналы из-за связывания зонда nonamplified грунтовок или праймер-димеров продукт может быть исследована путем проведения ПЦР с одного на основе геля обнаружения и последующего секвенирования. Если это произойдет, редизайн зондов, которые могут потребоваться. Точечные мутации в сайтах связывания зонда может привести к слабой или отсутствия сигналов. Разрешение двух зондов для каждого продукта усиливается делает это легко обнаружить. Эта особенность может быть использована с тщательной грунтовки и зонда дизайн для обнаружения малых изменений последовательности ДНК-мишени.
Таким образом, в то время как Есть много методов обнаружения следующих продуктов мультиплекс ПЦР доступны, mPCR / RLB имеет преимущество в том, высокую пропускную способность и недорогую установку с низким затрат. Гибкость метода позволяет использовать его в для широкого спектра применений.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мэттью О `Салливан и Фэй Чжоу являются получателями Австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета последипломного Стипендии медицинских исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5’ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
| 20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
| BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20x20 cm | Pall Corporation | 74480C | |
| Deionised, purified water | |||
| Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
| Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche Group | 11 089 153 001 | |
| Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
| Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
| OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
| Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18x24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
| Ice | |||
| Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay. | |||
| Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
| The Belly Dancer rocking platform | Stovall Life Sciences, IBI Sciences | Euro BDbo | |
| Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
| Water bath | |||
| Suction | |||
| Hot plate | |||
| Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
| X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film | ||
| Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay. | |||
References
- O'Sullivan, M. V., Cai, Y., Kong, F., Zeng, X., Gilbert, G. L. Influence of disk separation distance on accuracy of the disk approximation test for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp. J Clin Microbiol. 44, 4072-4076 (2006).
- Zeng, X., Kong, F., Wang, H., Darbar, A., Gilbert, G. L. Simultaneous detection of nine antibiotic resistance-related genes in Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization assay. Antimicrob Agents Chemother. 50, 204-209 (2006).
- Cai, Y. Comparison of single- and multilocus sequence typing and toxin gene profiling for characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol. 45, 3302-3308 (2007).
- Cai, L. A new multiplex PCR-based reverse line-blot hybridization (mPCR/RLB) assay for rapid staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing. J Med Microbiol. 58, 1045-1057 (2009).
- O'Sullivan, M. V., Kong, F., Sintchenko, V., Gilbert, G. L. Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus transmission in hospitals by use of phage-derived open reading frame typing enhanced by multiplex PCR and reverse line blot assay. J Clin Microbiol. 48, 2741-2748 (2010).
- Wang, Q., Kong, F., Jelfs, P., Gilbert, G. L. Extended phage locus typing of Salmonella enterica serovar Typhimurium, using multiplex PCR-based reverse line blot hybridization. J Med Microbiol. 57, 827-838 (2008).
- Zhou, F., Kong, F., Tong, Z., Gilbert, G. L. Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay. J Clin Microbiol. 45, 3411-3415 (2007).
- Kong, F., Brown, M., Sabananthan, A., Zeng, X., Gilbert, G. L. Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes. J Clin Microbiol. 44, 1887-1891 (2006).
- Kong, F., Ma, L., Gilbert, G. L. Simultaneous detection and serotype identification of Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization. J Med Microbiol. 54, 1133-1138 (2005).
- Zhou, F. Identification of 20 common human enterovirus serotypes by use of a reverse transcription-PCR-based reverse line blot hybridization assay. J Clin Microbiol. 47, 2737-2743 (2009).
- Zhou, F. Molecular identification and analysis of nonserotypeable human enteroviruses. J Clin Microbiol. 48, 1276-1282 (2010).
- Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J., Gilbert, G. L. Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 mycobacterium species. J Clin Microbiol. 44, 3544-3550 (2006).
- Wang, H., Kong, F., Wang, B., McKechnie, M. L., Gilbert, G. L. Multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay to detect common genital pathogens. Int J STD AIDS. 21, 320-325 (2010).
- McKechnie, M. L. Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay. J Clin Microbiol. 47, 1871-1877 (2009).
- Xiong, L., Kong, F., Zhou, H., Gilbert, G. L. Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol. 44, 1413-1418 (2006).
- Wang, Y., Kong, F., Yang, Y., Gilbert, G. L. A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia. Pediatr Pulmonol. 43, 150-159 (2008).
- Wang, Y. Use of a multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridisation assay for the rapid identification of bacterial pathogens. Clin Microbiol Infect. 14, 155-160 (2008).
- Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization. Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).
- Kong, F., Gilbert, G. L. Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool. Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).
