Summary
Immünhistokimya ve konfokal mikroskobu ile Corti organı, kesit vibratome basit bir prosedür açıklanmıştır. Bu prosedür, Corti memeli organı ince hücre mimarisini geliştirilmiş koruma sağlar ve dolayısıyla hücre tipleri doğru ölçümü için izin verir.
Abstract
Corti memeli organı mechanosensory saç ve nonsensory destekleyici hücrelerin yüksek sipariş hücresel bir mozaik
(1,2 gözden) bu hücresel mozaik Görselleştirme Corti organı genellikle kesitli olmasını gerektirir. Özellikle, çekirdekleri dorsalde saç hücreleri ile ilgili bulunmaktadır nonsensory ayağı ve Deiters hücreleri, Corti organı kesit alma görüntülendi olamaz. Ancak, sütun ve Deiters hücreleri ince sitoplazmik süreçleri de dahil olmak üzere, memeli Corti organı hassas hücre mimarisini, standart immünohistokimyasal boyama teknikleri ile uyumlu, parafin ve cryo-kesit gibi rutin histolojik prosedürleri korumak için zordur.
İşte ben konfokal mikroskobu ile takip koklea, tüm montaj bu vibratome bölümlerde immünohistokimyasal kesit vibratome oluşan basit ve sağlam bir prosedür açıklanmaktadır. Bu prosedür, fare bacak tomurcuk, zebrafish bağırsak, karaciğer, pankreas, ve kalp (seçilen örnekler için bkz: 3-6) de dahil olmak üzere birçok organı, immunhistochemical analizi için yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Buna ek olarak, bu yordamı Corti embriyo ve yetişkin farelerin 7 hem de mutant ve kontrol organları ayağı hücre sayısı hem de görüntüleme ve quantitificaton sucessful. Bu yöntem, ancak, şu anda yaygın olarak Corti memeli organı incelemek için kullanılan değildir. Corti yetişkin organ ince hücre mimarisini gelişmiş koruma sağlamak ve çeşitli hücre tipleri ölçümü için izin hem de bu işlem için potansiyel açıklanmıştır.
Protocol
1. Iç kulakları izolasyon ve sabitleme
- Corti organı hücresel desenlendirme analizi için, euthanize uygun embriyolar veya yetişkin düzenledi.
- Membranöz iç kulak içeren, otik kapsül parçalara ayır. Fare, bu embriyonik az (E) günlük 14.5 ve üstü, E0.5 vajinal fişi tespit edildiği gün embriyonlar üzerinde kolayca yapılabilir. Otik kapsül Diseksiyon orta hatta ve kafatasının açılması dekapitasyon ilk gerçekleştirilir. (Şekil 1A) her bir kulak maruz beyin çıkarın. İç kulakları sağlam kullanarak forseps (Dumont # 5, Şekil 1B gibi) kabuklu olabilir. Eğer görüntüleme Corti organı, otik kapsül ile ilişkili tüm nöronal ve bağ dokusu dikkatli çıkarılması gerekli değildir.
- 4 nazik sallanan% 4 paraformaldehid daldırma (PFA) tarafından tüm iç kulakları Fix ° C 1.8 ml vidalı kapaklı Nunc Cryo-tüp şişeleri ya da diğer uygun büyüklükte konteyner geceleme. PFA çözüm, GKD 2 0 -20 ° C'de saklanan kadar gerekli taze yapılmış olmalıdır.
- Ertesi gün, üç değişiklik 1X fosfat fiksatif yıkayın tuzlu su (PBS) tamponlu. Işlenmek üzere hazır olana kadar Doku ay gün kadar steril 1X PBS içinde saklanabilir. Yetişkin doku, 4% 10 EDTA (0.27 M) kirecini ° 5 gün boyunca C, durulama ve 1X PBS depolama ile izledi.
2. Kesme vibratome bölümleri
- 1X PBS% 4 Düşük Erime Noktası agaroz hazırlayın. Agaroz çözüm gelene kadar düşük erime noktası agaroz 1X PBS ve mikrodalga ekleyin. Çözüm üzerinde baloncuk olmadığını özen - periyodik mikrodalga ve karıştırmak için girdap çıkarmak. Kullanıma hazır olana kadar 55 ° C su banyosunda çözüm tutun.
- Forseps kullanarak 1X PBS çözüm ve altındaki bir Peel-A-Way gömme kalıp konumu, iç kulak çıkarın. Pipetleyin uzakta kalıp herhangi bir aşırı 1X PBS. Bol sıvı% 4 Düşük Erime Noktası agaroz (Şekil 2A) ile doku kapağı kalıp doldurun.
- Uygun düzlemde kesit için iç kulak yerleştirin. Ben kafa in situ kalmıştı sanki otik kapsül konumunu AB'ye yakınlaştırılması ve transvers düzlemde kesit Corti organı iyi kesitler elde edilmiştir. E14.5 embriyolar için görünür lateral yarı dairesel kanal (Şekil 2B), yanal görülüyor böylece yetişkin, konumu, iç kulak. Otik kapsül arka tarafında oluşan çizgi kesit (Şekil 2A, B) amaçlanan uçaktan 45 derecelik bir açıyla yaklaşık böylece iç kulak Açısı. Otik kapsül otik kapsül dorsal bölümünün üst kısmında yer alır, böylece görüntülendiğinde, koklea bazal kıvrımı alt (ok ucu, Şekil 2B) bulunan ve ön yarı dairesel kanal (Artan) olmalıdır üst (Şekil 2B).
- Agaroz 30 dakika içinde RT koyacaktır. Transferi Peel-Away kalıpları ° C bölümüne hazır olana kadar 4 gömülü doku içeren. Kesit, bir sonraki güne kadar ertelendi olacaksa, 1X PBS 1X PBS batırılmış nemli kağıt havlu içeren bir kutu içinde kalıp ve mağaza agaroz kapsayacak şekilde ekleyin.
- Plastik kalıp uzakta soyun. Bir jilet kullanarak, iç kulak dokusu içeren bir agaroz kutusu kesti. Düzlemine bölümünde agaroz blok aşağıya yapıştırılmış olduğu yüzey olacak blok karşı tarafında, düz ve paralel olmasını sağlamak için özen gösterin. Agaroz doku sızmak olmadığından, doku iyi desteklenmiş olacak, böylece, doku dört bir yanından gelen çok agaroz Döşeme yok.
- Kesim yüzeyi blok eklemek superglue kullanın.
- Vibratome 40 ila 100 mikron kalınlığında Bölüm. 1X PBS,% 0.1 TritonX-100 ile dolu bir doku kültürü çanak bölümleri kaydedin. Şekil koklear spiral aracılığıyla bir temsilci bölümünde gösterilmiştir. 2C.
- Forseps doku agaroz incelemek için kullanın. Agaroz dokuya penetre olmaz, ama sadece iç kulakta dış yüzeyine yapışmış olacak.
- İsterseniz, havuz, agaroz-kesitli doku doku aşırı kesme önlemek için büyük bir delik açılmasıyla pipetlemeyin kullanarak. Veya 24-iyi doku kültürü çanak çok farklı dokular üzerinde birden fazla antikor lekeleri performans, bölümleri, 16 organize edilebilir.
3. Antikor boyama vibratome bölümleri
Antikor leke ile devam edin. Bütün montaj Süreç bölümleri, serbest yüzen bir çözüm. Aşağıda Corti organı ayağı hücrelerinin S100 işaretleyici için bir örnek antikor boyama protokolü, ancak protokol herhangi bir antikor için kullanılabilir. Tüm yıkar, aksi belirtilmediği sürece oda sıcaklığında yapılır.
- 30 dakika boyunca çok iyi doku kültürü çanak, PBT nazik sallanan (1X PBS,% 1 sığır serum albumin,% 0.1 Triton X-100) ile serbest bölümler kuluçkaya yatmaktadır.
- Eski çözüm ve blok serbest fl kapalı pipetleyin30 dakika, PBT + normal keçi serumu hafif sallanan (50 ul NGS / 1 ml PBT) bölümleri oating.
- Eski çözüm kapalı pipetleyin ve PBT + NGS (PBT + NGS S100 1:200 dilüsyon) seyreltilmiş primer antikor ekleyin. Gece 4 ° C'de nazik sallanan.
- Primer antikor çözümü kapalı pipetleyin. 5 dakika 3X yıkayın. PBT, 4X, 30 dakika. PBT ile.
- PBT + NGS Blok, 30 dakika.
- PBT + NGS sulandırılmış floresan konjuge sekonder antikoru (keçi yetiştirilen) ile inkübe edin. 4 gece boyunca inkübe ° C, ya da bir kaç saat, RT, nazik sallanan.
- Sekonder antikor çözüm kapalı pipetleyin. , 5 dakika yıkayın 3X, 4X, 30 dakika. PBT ile.
- Son PBT kapalı pipetleyin yıkayın ve bir nükleer counterstain içeren sulu uygun montaj orta ile değiştirin.
4. Slaytlar ve konfokal mikroskobi montaj bölümleri
Lamel ile kalınlığında kesitler kırma önlemek için, ayrı ayrı bölümlerin monte ederken, bir spacer mikroskop slayt ve lamel arasında takılı olmalıdır. Aşağıda kalın vibratome bölümleri montaj iki alternatif yöntemler şunlardır:
- Bir boşluk, bir vakum gres jant doku bölümü etrafında bir kare koyarak oluşturulabilir. Böylece, lamel koyan, lamel kenarlarında vakum gres ile kapatılmış olacak. Slayt üzerine sıkı bir şekilde uyması için başparmak ile lamel kenarlarını bastırın. Vakum gres lamel tüm kenarlarında düzgün ve yeknesak mevcut ise, slayt, ters bir konfokal mikroskop kullanım için yeteri kadar mühürlü olacaktır.
- Alternatif olarak, bir spacer bilinen mesh boyutu agaroz kromatografisi reçine (Affi-Gel Blue Jel, Bio-Rad) kullanılarak oluşturulabilir. Pipetleyin 1 lamel alınacaktır dört bir köşesinden her mikroskop lamı üzerine reçine ul. Reçine dört nokta ortasına pipetleyin bir doku bölümü ve montaj medya. Lamel. Eğer ters bir konfokal mikroskop kullanılarak, oje kullanılarak mikroskop lamı üzerine lamel mühür.
- Konfokal mikroskopi kullanılarak boyandı vibratome dilim optik bölümleri alın. Corti organı içinde çeşitli hücre tipleri ölçmek için, tanımlanmış bir adım boyutu (1,5 ve 3 mikron arasında) z-yığını edinin. Bölüm 3.8) (adım nükleer bir boya ile karşı-lekeli olmalıdır. Görüntüler konfokal görüntü toplandıktan sonra herhangi bir bilgisayar ekranından kontrol edilebilir. Hücreler görüntüler z yığın içinde sırayla incelenir manuel olarak çekirdeklerin görünüm ve ortadan kalkması gözlemleyerek sayılabilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Ayağı ve Deiters hücreleri bulunan ve nükleer bir boya (Şekil 3A-F) ile zıt S100 protein, lekeli bir vibratome bölümü aracılığıyla bir temsilci konfokal z yığını. Her panel panel, 3 mikron adımları alınan konfokal görüntü konfokal görüntü vibratome bölümünde F vibratome bölüm içinde en içten elde konfokal görüntü ve panel yüzeyine yakın aldı. Corti organı morfolojisi minimal kesintiye görünür. Özellikle, ayağı hücrelerinin sitoplazmik uzantıları kırık değil. Z-yığını (Şekil 3A 3F ile) aracılığıyla ayağı hücre çekirdeğinin görünüm ve ortadan kalkması belirterek, hem iç ve dış ayağı hücre sayısı (- F numaralandırma, Şekil 3A) sayılabilir. Konfokal görüntü başına her hücre tipi sayısının az olması nedeniyle, bu yaklaşım içinde en fazla hücre tipleri Corti organı saymak için kullanılabilir.
Şekil 1 bozulmamış, 15 hafta, yetişkin iç kulakları otik kapsül kaplı. (A) sağ otik kapsül (köşeli ayraç), beyin çıkarıldıktan sonra, kafasının içinde bir noktadan bakıldığında, kafatası kaplı. Anterior hakkı. (B) Bozulmamış, 15 hafta eski iç kafatası diseksiyonu sonra kulakları. Sol iç kulak lateral yüzeyinde görünür; sağ iç kulak medial yüzeyi görünür. Etiketler ön yarı dairesel kanal (asc), eş (koklea) ve ow (oval pencere) yerleri gösterir.
Şekil 2 (A) Tüm Peel-Away kalıp merkezi agaroz gömülü 15 hafta eski bir yetişkin, iç kulak . Bölümünde amaçlanan düzlemde gösterilir. Gömülü önce 15 hafta, bütün iç kulak (B) Close-up görüntü. Membranöz labirent daha net bir izlenenler böylece çevresindeki kemiğin bir kısmı uzakta diseke edilmiştir. Yanal yarı dairesel kanal (LSC), ön yarı dairesel kanal (Artan) ve koklea (co) (beyaz eğrileri) izlenmektedir. Bazal açmak ve koklea (ok ucu) bölümü (kesikli çizgi) amaçlanan düzlemde gösterilir. (C) Temsilcisi Cross-koklea yoluyla bölümü. Koklear kanal aracılığıyla bir kesit, Corti organı (oC) kutulu, stria vascularis (sv), parantez içine alınmış olan ve Reissner membran (Rm) gösterilir.
Şekil 3 P21 at yabani tip fare Corti organı. Bir ayağı hücreleri ve Deiters görselleştirmek için Corti S100 antikor lekeli organ üzerinden 3 mikron adım boyutu, 'hücrelerinde (AF) Sıralı konfokal serisi. Serinin sonuna kadar başından itibaren iç ve dış ayağı hücreleri sayar numaralı. Kısaltmalar: İHK (iç saç hücresi), aIHC (komşu iç saç hücresi), OHC (dış saç hücresi), Bilgisayar (ayağı hücre), DC (Deiters 'hücre).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immünhistokimya ve konfokal görüntüleme ile takip vibratome kesit, prosedür, minimal doku hasarı ile Corti organı görselleştirme sağlar. Açıkçası, vibratome bölümünde iç bölgelerinden alınan konfokal görüntüler sadece fiksasyon eserler ile sınırlıdır hücresel morfoloji mükemmel koruma göstermektedir. Ara sıra ayağı hücrelerinin sitoplazmik uzantıları sonları gibi hücresel kesintileri, (gösterilmemiştir) gözlemlenmesine rağmen yakın bir vibratome bölümü iki kesim yüzeyleri alınan Konfokal resimler, genellikle iç bölgelerden gelen görüntülerden ayırt edilemez. Bu yaklaşım, basit, ve en önemli ekipman ürün - vibratome makine ve konfokal mikroskop - genellikle, çoğu araştırmacı için ulaşılabilir ortak ekipman öğelerdir. Buna ek olarak, bu yaklaşım Corti organı spesifik boyanması gösteren herhangi bir antikor için kullanılabilir. Gerçekten de, bu yaklaşımın temel sınırlama antikor özgüllüğü ve bu protokolün 3. adıma değişiklikler belirli bir antikor spesifik boyanması sonucu olduğundan emin olmak için gerekli olabilir. Özet olarak, basit bir yöntemle, herhangi bir antikor genellenememektedir ve Corti organı hücresel organizasyonun maksimum korunması ve analiz sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hayvanlar üzerinde yapılan deneyler, Wisconsin IACUC Tıp Koleji tarafından belirlenen kurallara ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Acknowledgments
Yazar agaroz boncuklar kullanarak bölümleri mount öneri konfokal mikroskopi ve Dr. Jian Zhang Çocuk Araştırma Enstitüsü Imaging Core kullanımı kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe DC010387 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica Microsystems | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences, Inc. | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher Scientific | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision. Dev Cell. 15, 738-748 (2008).
- Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development. Nature. 418, 501-508 (2002).
- Trinh, L. A., Stainier, D. Y. Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish. Dev Cell. 6, 371-382 (2004).
- Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish. Dev Cell. 18, 973-984 (2010).
- Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling. Dev Cell. 8, 553-564 (2005).
