Summary
Les cellules interstitielles de Cajal (CIC) sont les cellules pacemaker de gastro-intestinal (GI). Ils forment des réseaux complexes entre les cellules musculaires lisses et de fibres post-ganglionnaires neuronales pour réguler la contractilité IG. Ici, nous présentons les méthodes d'immunofluorescence transversale et l'ensemble de montage de visualisation des réseaux de la CPI murin.
Abstract
Les cellules interstitielles de Cajal (CIC) sont mésenchymateuses dérivées "cellules pacemaker» de la gastro-intestinal (GI) qui génèrent des ondes lentes spontanées requis pour le péristaltisme et de médiation de l'entrée neuronale system1 nerveux entérique. Différents sous-types de la CCI forment des réseaux distincts dans la musculeuse du tractus GI 2,3. Perte ou dommages à ces réseaux est associée à un certain nombre de troubles de la motilité 4. CPI cellules expriment la tyrosine kinase du récepteur KIT sur la membrane plasmique et KIT immunomarquage a été utilisé pour les 15 dernières années à l'étiquette le réseau des CCI 5,6. Surtout, l'activité normale KIT est requis pour le développement de la CPI 5,6. Transformation néoplasique des résultats des cellules de la CPI dans les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST), qui souvent le port de mutations KIT gain de fonction de 7,8. Nous avons récemment montré que ETV1 est un facteur de survie lignée spécifiques exprimées dans la lignée de la CPI / GIST et est un maître régulateur transcriptionnel nécessaire à la fois la formation normale du réseau de la CPI et pour la tumorigenèse de 9 GIST. Nous avons en outre démontrer qu'il coopère avec des mutations activatrices KIT dans la tumorigenèse. Ici, nous décrivons les méthodes de visualisation des réseaux de la CPI sur des souris, largement basé sur les protocoles déjà publiés 10,11. Plus récemment, le canal chlorure anoctamin 1 (ANO1) a également été caractérisé comme un marqueur membranaire spécifique de la CPI 11,12. En raison de leur localisation membrane plasmique, immunofluorescence des deux protéines peut être utilisé pour visualiser les réseaux de la CPI. Ici, nous décrivons la visualisation de la CPI par les réseaux fixes et préparations surgelés cyrosections monter ensemble.
Protocol
1. La dissection de la souris tractus gastro-intestinal
- Souris euthanasiés par les directives locales IUCAC
- Pin chaque membre sur la surface de styromousse et rincer la surface abdominale avec 70% d'éthanol. Ouvrez cavité abdominale avec incision médiane à long du diaphragme au pubis. Faire une coupe à l'oesophage distal et une seconde coupe à l'intestin distal large et retirer le tube digestif de l'estomac à l'anus en bloc, bien couper les ligaments au niveau du duodénum et le caecum en utilisant de petits ciseaux. Placez tractus gastro-intestinal dans une boîte de Pétri avec du PBS. Disséquer loin mésentère utilisant une pince à épiler (figure 1). Pour séparer l'estomac, l'intestin grêle et le gros intestin, coupées à la jonction pylore et iléo-colique. Rincer la lumière de chaque partie du tractus gastro-intestinal avec PBS aide d'une seringue 5ml attaché à une aiguille d'alimentation (souris âgées) ou aiguille émoussée (jeunes souris).
- Ouvrez l'estomac, l'intestin grêle et le gros intestin le long de la frontière mésentérique. Coupez deux morceaux pour chaque partie du tractus gastro-intestinal, l'un pour la visualisation monter ensemble et un pour cryosection.
2. Whole préparation des échantillons monter et immunomarquage
- Placer le morceau entier de chaque partie du tractus gastro-intestinal dans un tube de 1,5 cm microcentrifugeuse rempli de 1,0 ml d'acétone glacée et des échantillons de correctif pour au moins 1 heure à 4 ° C. Les échantillons peuvent être conservés jusqu'à 1 semaine à -20 ° C. Nous généralement conserver les échantillons dans de l'acétone et de commencer à préparer cyrosections.
- Laver l'échantillon 2X avec du PBS. Placer l'échantillon dans la boîte de Pétri avec du PBS. Sous dissection miscroscope, soigneusement gratter la couche muqueuse avec un scalpel en tenant une extrémité avec une pince à épiler, laissant la musculeuse.
- Musculaires peuvent être coupés en morceaux de 5 mm pour la coloration avec des anticorps différents. Ne pas stocker plus de deux jours dans du PBS avant coloration.
- Étapes de bloc et d'incubation qui peut être fait dans un puits d'une plaque de 24 puits ou dans un tube de micro 1.5ml. Bloc avec 0,5 ml de tampon de blocage (sérum de chèvre 5%, 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 1 heure à 4 ° C).
- Incuber avec l'anticorps primaire dilué dans du tampon de blocage et tourner la nuit à 4 ° C. Nous avons utilisé avec succès ACK-2 de rat anti-Kit, lapin anti-Ano1, et de lapin anti-PGP9.5 anticorps pour immunomarquage monter ensemble.
- Laver pendant 5 min avec du PBS 2X sur les rotateurs à température ambiante.
- Incuber avec l'anticorps secondaire dilué dans du tampon de blocage pendant 2 heures à température ambiante sur des rotateurs. Nous utilisons généralement Alexa Fluor 488 anti-lapin et Alexa Fluor 594 anticorps anti-rat.
- Laver pendant 15 min avec du PBS 3X sur les rotateurs à température ambiante.
- Mont sur la diapositive, côté séreux sur le dessus pour assurer l'orientation des tissus au cours de la microscopie. Cette orientation sera d'assurer la côté séreux faire face à la lamelle et être rencontrées d'abord comme on se concentre sur la diapositive sur un microscope. Nous faisons cela sur un microscope à dissection. Parfois, nous examinons brièvement les tissus sous microscope à fluorescence pour orienter correctement. Sous la microscopie par fluorescence pour visualiser Kit ou Ano1, on devrait rencontrer le CPI-MY premier réseau du côté de la lamelle. Ensuite, aspirez PBS autant que possible, sans séchage complet. Ajouter 50 ul de médias mis en dur de montage (nous utilisons Prolongez Gold) et placez doucement lamelle sur le dessus du tissu. Permet de définir de montage nuit à température ambiante et de diapositives conserver à -80 ° C.
- Pour l'examen microscopique, nous avons utilisé un microscope à champ large avec un Z-drive. Nous avons utilisé soit un objectif de 20X air (NA 0,75, Plan Apochromat) ou l'objectif du pétrole 60X (NA 1,4, Plan Apochromat) et a pris 2 um um ou 1 Z-sections qui couvrent l'ensemble de la musculeuse. Les images ont ensuite été déconvolué en utilisant le logiciel de déconvolution Autoquant. Sinon, beaucoup d'autres ont utilisé la microscopie confocale à la place avec des résultats similaires.
3. La préparation et immunocoloration Cryosection
- Placer chaque partie du tractus gastro-intestinal, côté séreux vers le bas, à plat sur un papier filtre. Couper le papier filtre autour du tissu. Placer le tissu sur un papier filtre dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS (on dilue paraformaldéhyde 32% en flacon scellé dans du PBS juste avant utilisation) pendant 2 heures à température ambiante. La fixation peut se faire dans un 6 - ou à 12 puits Plaque selon la taille des tissus, ou dans un tube de 1,5 ml. Si c'est fait dans l'assiette, du parafilm pour minimiser l'exposition PFA. Temps de fixation plus longues peuvent entraîner masquage des antigènes, en particulier pour le ACK-2 anti-Kit anticorps.
- Enlever les tissus de l'IFP et le lieu de saccharose à 30% dans le PBS. Autoriser les tissus à sombrer dans la nuit à 4 ° C.
- Equilibrer les tissus avec 1:1 ratio de 30% de sucrose et PTOM pendant 1 heure. Montez ensuite le tissu verticalement dans cryomold rempli PTOM Le axe longitudinal du tube digestif doit être en parallèle avec le cyrosections. Lors de l'examen des souris avec des génotypes différents ou avec des traitements différents, il peut être utile pour monter des tissus de souris différents sur cryomold mêmes pour assurer le traitement en parallèle. Freeze sur la glace sèche et placer dans un congélateur à -80 ° C pour le stockage.
- Couper 10 cryocoupes umsur la glissière et conserver à -80 ° C au congélateur. Nous habituellement coupé deux sections par diapositive. Nous avons également exécutent habituellement coloration H & E d'une diapositive cryosection.
- Pour l'immunofluorescence, d'abord d'équilibrer glisser à la température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, dessinez cercle autour du tissu en utilisant un stylo PAP.
- Bloc avec 150 ul de tampon de blocage (le même que pour le montage immunomarquage entier) pendant 1 heure.
- Aspirer le tampon de blocage et ajouter 150 ul d'anticorps primaire dilué dans du tampon de blocage et incuber une nuit à 4 ° C dans une chambre humidifiée.
- Laver 5 min avec du PBS 2X.
- Incuber avec l'anticorps secondaire dilué dans du tampon de blocage pendant 2 heures à température ambiante. Nous utilisons généralement Alexa 488 anti-lapin et Alexa 594 anticorps anti-rat.
- Laver pendant 15 min avec du PBS 3X.
- Aspirer glisser sans complètement sécher les tissus. Ajouter une goutte de jeu dure montage de médias au DAPI (nous utilisons Prolongez l'or) et la place # 1.5 lamelle. Placer la lame à température ambiante pendant une nuit de définir et de stocker dans -80 ° C au congélateur.
- Acquérir des images de fluorescence en utilisant trois DAPI, FITC et au Texas Red jeux de filtres.
4. Les résultats représentatifs:
Ici, nous utilisons le gros intestin comme un exemple. H & E tache d'une saccharose fixes protégés extemporané utilisés pour l'immunofluorescence montre des artefacts par rapport à une section de paraffine de référence (figure 2), où la ligne jaune demarks plexus myentérique entre les couches musculaires longitudinales et circulaires et le demarks ligne verte de la frontière entre le muqueuse et muscularlis. L'examen de la cryosection, à partir de la séreuse à la muqueuse, votre première rencontre avec le mince muscle longitudinal (LM) couche suivie par le plus épais du muscle (CM) La circulaire de la couche. La section doit être en parallèle avec le muscle longitudinal de sorte que le noyau des LM devrait être un peu allongé tandis que les noyaux de la CM doivent être petits et ronds. Entre le LM et CM sont plexi myentériques faite de neurones qui tache avec PGP9.5. PGP9.5 également les processus neuronaux taches tout au long du CM. Le réseau de la CPI myentérique (CCI-MA) entourent le plexus myentérique et sont faits de cellules multipolaires. Au sein de la couche musculaire longitudinale, il est rare CCI intramusculaire (CPI-IMS) qui sont des cellules bipolaires fonctionnant en parallèle avec le muscle. Au sein de la couche musculaire circulaire, il ya abondance de la CPI-IMS, qui sont aussi des cellules bipolaires qui fonctionnent en parallèle avec le muscle circulaire et sont à section avec cette coupe. À la jonction de la musculeuse et la sous-muqueuse, le réseau sous-muqueux de la CPI composée de CPI-PSM est un réseau des CCI plate multipolaire. Examiner le kit de montage toute immunomarquage du gros intestin, on doit s'attendre à rencontrer la CPI-MY premier réseau, puis de la CPI-IM de la CM et la CCI-SMP réseaux, comme on se concentre de la lamelle (Figure. 3) . Mesure volumétrique des réseaux de la CCI en utilisant la reconstruction 3D de l'ensemble de montage des images ont été décrits 10. L'utilisation à large champ de microscope, il est significatif hors-plan de fluorescence dans les images brutes qui peuvent être retirés après déconvolution (figure 3). Incomplet décapage de la muqueuse se traduira par la fluorescence de fond élevé. ANO1 est un autre marqueur de la CPI et co-immunomarquage du KIT et ANO1 montre chevauchement complet de la coloration de la CPI (figure 4).
Représentant la figure 1. Disséqué tractus gastro-intestinal de souris, reproduit avec l'autorisation 13.
Figure 2. A) Représentant coloration H & E de l'intestin de souris grand cryocoupes préparé comme décrit et la paraffine de référence intégré coupe montrant des artefacts rétrécissement de cryocoupes. La ligne jaune demarks plexus myentérique et la ligne bleue sépare la muqueuse de la musculeuse. B) Représentant Kit (rouge, ACK-2) et PGP9.5 (vert) immunofluorescence double avec DAPI (bleu) contre-coloration de l'intestin de souris grand. LM: CM musculaires longitudinales: muscle circulaire. Barre d'échelle de 20 um.
Figure 3. Représentant Kit (rouge, ACK-2) l'ensemble de montage immunofluorescence du même champ à trois plans focaux, l'ICC mon avion à la frontière LM / CM, le plan de la CCI-IM dans le CM, et l'ICC- SMP avion à la frontière CM / sous-muqueuse. Les images brutes et les images déconvolué sont affichés. Barre d'échelle de 20 um.
Figure 4. Représentant double immunofluorescence de Ano1 (vert) et Kit (rouge, ACK-2) dans le gros intestin. Barre d'échelle de 20 um.
Discussion
Les cellules interstitielles de Cajal ont été initialement caractérisées par Santiago Ramóón y Cajal exactement un siècle, il ya des taches à l'aide de méthylène chromate bleu et argent de la musculeuse digestive. Cajal abord pensé CPI ont été neurones en fonction de leurs procédés qui rappellent des axones et des dendrites. Plus de nombreuses années qui ont suivi, l'étude de la biologie de la CPI a été limitée par le manque de marqueurs spécifiques jusqu'à la découverte de ce kit n'est pas seulement exprimée dans la CPI, mais il est également nécessaire pour leur développement 6. Depuis lors, KIT immunofluorescence a été largement utilisé dans l'étude de la biologie et la CPI a également conduit à l'appréciation de la CPI dans d'autres organes contractiles tels que la vessie. Récemment, ANO1 a été identifié comme un marqueur de la CPI seconde fiable.
Il ya eu de nombreuses publications au cours des 15 dernières années par immunofluorescence pour identifier ICC en utilisant diverses techniques de fixation de montage. Dans nos mains "fixe gelé" cryocoupes qui ont été précédées de paraformaldéhyde et de saccharose, d'œuvres protégées par rapport aux meilleures acétone ou paraformaldéhyde post-fixation après cryosectioning. Pour les montages ensemble, nous avons constaté que la fixation acétone suivie d'une dissection muqueuse donne les résultats les plus robustes.
Historiquement, le ACK-2 a été l'anticorps Kit de choix pour les souris de la CPI d'identification. Il est un rat monoclonal qui reconnaît le domaine extracellulaire et il est également un anticorps bloquant qui provoque un iléus lorsqu'il est administré à la souris vivante. Cependant, l'épitope ACK-2 est lentement détruite par la fixation de paraformaldéhyde et n'est pas sauvé par des méthodes standard de récupération d'antigène. Nous avons constaté que l'épitope ACK-4 est plus résistant à la fixation de paraformaldéhyde. Par rapport à fixée blocs congelés et des sections, des blocs de paraffine et des sections préserve la morphologie mieux et est plus favorable à l'archivage à long terme (figure 4). Ni ACK ACK-2 ni-4 ont été utilisés avec succès dans des coupes en paraffine. Nous avons caractérisé cette D13A2, un anticorps monoclonal nouveau lapin, fonctionne exceptionnellement bien dans les deux sections fixes gelés et la paraffine du tractus GI.
Kit est exprimé dans plusieurs autres types cellulaires, y compris les mélanocytes, les cellules hématopoïétiques, les cellules germinales, et en particulier les mastocytes, qui sont également présents dans le tractus gastro-intestinal. Heureusement, la plupart des cellules de mât sont trouvé est la muqueuse et non pas dans la musculeuse. Double coloration de lapin anti-Ano1 et de rat anti-Kit permet d'éliminer non spécifiques coloration de chaque anticorps (figure 4). Il est également intéressant de noter que l'expression relative de Kit et Ano1 entre sous-classes de la CPI semble différent. Par exemple, dans le petit intestin, coloration Kit est beaucoup plus intense dans myentérique CPI par rapport à la CCI du muscle en profondeur du plexus alors Ano1 coloration est comparable.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Cancer Institute (K08CA140946, au YC), (5F32CA130372, pour PC), (R01CA102774 et R01HL055748 à PB), le ministère de la Défense (PC094302 au YC), le Fonds de la famille Shuman de recherche GIST (pour PC), et le Cancer Consortium Starr (pour PC, YC, CLS et PB). Nous tenons à remercier Katia Manova, Fan Ning, et Mesurh Türkekul de l'installation MSKCC Cytologie Moléculaire de base pour aider à cryosectioning et immunocoloration.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-2) | eBioscience | 14-1172 | Use at 2μg/ml. Epitope is lost with overfixation. |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-4) | Cedarlane Labs | CL8936AP | Use at 2μg/ml. |
| rabbit anti-KIT antibody (clone D13A2) | Cell Signaling Technology | 3074 | Use at 1:100 dilution. Only antibody listed here that works well in paraffin sections. |
| rabbit anti-Pgp9.5 antibody | Abcam | ab10404 | Labels neuronal cell cytoplasm. Useful for marking neurons of the myenteric plexus. Use at 1:1000 dilution. |
| rabbit anti-Ano1 antibody | Abcam | ab53212 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rat IgG | Invitrogen | A-11007 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11008 | Use at 2μg/ml |
| Animal Feeding Needle | Fisher Scientific | 01-208-87 | Silicon tipped needle useful for flushing GI tract of adult mice |
| Blunt Needle | BD Biosciences | 305180 | Blunt needle useful for flushing GI tract of pre-weaned pups |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | May use alternative hard-setting mounting media with DAPI |
| Tissue-Tek Cryomold | Tissue-Tek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Tissue-Tek | 4583 | |
| 32% Paraformaldehyde (10ml sealed ampoule) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Open sealed ampoule and dilute to 4% just before use |
| Blocking buffer | 5% Goat serum, 0.1% Triton X-100 in PBS |
References
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