Summary
As células intersticiais de Cajal (ICC) são as células marcapasso do trato gastrointestinal (TGI). Eles formam redes complexas entre as células do músculo liso e fibras pós-ganglionares neuronal para regular a contratilidade GI. Aqui, apresentamos métodos de imunofluorescência transversal e todo o monte de visualização de redes murino ICC.
Abstract
As células intersticiais de Cajal (ICC) são mesenquimais derivadas "células marca-passo" do trato gastrointestinal (TGI) que geram ondas lentas espontânea necessários para o peristaltismo e mediar entrada neuronal do sistema1 nervoso entérico. Diferentes subtipos de ICC formar redes distintas na muscularis do trato gastrointestinal 2,3. Perdas ou danos a essas redes está associada a uma série de distúrbios de motilidade 4. Células ICC expressar a tirosina quinase do receptor KIT sobre a membrana plasmática e KIT imunocoloração tem sido usado nos últimos 15 anos a label da rede ICC 5,6. Importante, a atividade KIT normal é necessário para o desenvolvimento ICC 5,6. Transformação neoplásica de resultados ICC células no tumor estromal gastrointestinal (GIST), que freqüentemente porto mutações de ganho de função-KIT 7,8. Recentemente, mostrou que ETV1 é um fator de sobrevivência de linhagem específica expressa na linhagem ICC / GIST e é um regulador mestre de transcrição necessários para tanto a formação de rede normal ICC e para de tumorigênese GIST 9. Nós ainda demonstrar que coopera com mutações ativadoras KIT na tumorigênese. Aqui, descrevemos os métodos de visualização de redes de ICC em ratos, em grande parte com base em protocolos previamente publicados 10,11. Mais recentemente, o canal de cloro anoctamin 1 (ANO1) também tem sido caracterizada como um marcador específico de membranas de ICC 11,12. Devido a sua localização membrana plasmática, imunofluorescência de ambas as proteínas podem ser usadas para visualizar as redes ICC. Aqui, descrevemos a visualização das redes fixas por ICC congelado cyrosections e preparações montar todo.
Protocol
1. Dissecção do mouse trato GI
- Camundongos submetidos à eutanásia por locais diretrizes IUCAC
- Pin cada membro na superfície de isopor e enxaguar superfície abdominal com etanol 70%. Abra cavidade abdominal com incisão mediana longo do diafragma para púbis. Fazer um corte no esôfago distal e um segundo corte no intestino distal grande e remover o trato GI do estômago ao ânus em bloco, corte cuidadosamente ligamentos no duodeno e ceco com uma tesoura pequena. Trato GI lugar numa placa de Petri com PBS. Dissecar longe mesentério usando uma pinça (Figura 1). Para separar o estômago, intestino delgado e intestino grosso, cortado em piloro e junção ileocecal. Lavar o lúmen de cada parte do trato GI com PBS usando uma seringa de 5ml preso a uma agulha de alimentação (ratos mais velhos) ou agulha sem corte (ratos mais jovens).
- Estômago aberto, intestino delgado, intestino grosso e ao longo da borda mesentérica. Corte dois pedaços para cada parte do trato gastrointestinal, um para visualização montar todo e um para cryosection.
2. Preparação da amostra toda montagem e imunomarcação
- Coloque a peça inteira de cada parte do trato gastrointestinal em um tubo de microcentrífuga 1,5 centímetros cheia com 1,0 ml de acetona gelada e amostras de correção para pelo menos 1 hora a 4 ° C. Amostras podem ser armazenadas por até uma semana a -20 ° C. Nós normalmente armazenam amostras em acetona e prossiga para preparar cyrosections.
- Lave 2X amostra com PBS. Colocar a amostra em placa de Petri com PBS. Sob dissecar miscroscope, cuidadosamente raspar camada mucosa com um bisturi, segurando uma ponta com um par de pinças, deixando a muscularis.
- Muscular pode ser cortado em pedaços de 5 mm para coloração com anticorpos diferentes. Não armazenar por mais de dois dias em PBS antes da coloração.
- Passos de bloco e de incubação pode ser feito em um poço de uma placa de 24 poços ou em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Bloco com 0,5 ml de tampão de bloqueio (soro de cabra 5%, 0,1% Triton X-100 em PBS por 1 hora a 4 ° C).
- Incubar com anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio e rodar durante a noite a 4 ° C. Temos utilizado com sucesso ACK-2 rato anti-Kit, coelho anti-Ano1, e de coelho anti-Pgp9.5 anticorpos para a imunocoloração montar todo.
- Lavar por 5 min 2X com PBS em rotator em temperatura ambiente.
- Incubar com anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio por 2 horas a temperatura ambiente em rotador. Normalmente usamos Alexa Fluor 488 anti-coelho e Alexa Fluor 594 anti-rato anticorpos.
- Lavar por 15 min 3X com PBS em rotator em temperatura ambiente.
- Montagem no slide, lado seroso em cima para garantir a orientação do tecido durante a microscopia. Esta orientação irá garantir o lado seroso para enfrentar a lamela e ser encontrado primeiro como uma foca no slide em um microscópio. Fazemos isso em um microscópio de dissecação. Às vezes, examinaremos brevemente o tecido sob microscopia de fluorescência para orientar corretamente. Sob microscopia de fluorescência para visualizar Kit ou Ano1, deve-se encontrar o ICC-MY primeira rede do lado da lamela. Em seguida, aspirar PBS, tanto quanto possível, sem secar completamente. Adicionar 50 ul de media set difícil de montagem (usamos Prolong Gold) e coloque delicadamente lamínula em cima do tecido. Permitir configuração de montagem durante a noite a temperatura ambiente e slides armazenar a -80 ° C.
- Para exame microscópico, foi utilizado um microscópio de campo amplo com um Z-drive. Usamos tanto o objectivo de ar 20X (NA 0,75, Apochromat plano) ou objetivo do petróleo 60X (NA 1.4, Apochromat plano) e tomou 2 m ou 1 mícron Z-seções que abrangem a muscularis inteiro. As imagens foram posteriormente deconvoluídos usando software deconvolução Autoquant. Alternativamente, muitos outros usaram microscopia confocal vez com resultados semelhantes.
3. Preparação Cryosection e imunomarcação
- Coloque cada parte do trato GI, lado seroso baixo, flat em papel de filtro. Corte de papel de filtro em todo o tecido. Coloque o tecido em papel de filtro em paraformaldeído 4% (PFA) em PBS (nós diluir paraformaldeído 32% em frasco lacrado em PBS direito antes do uso) por 2 horas em temperatura ambiente. Fixação pode ser feito em um 6 - ou 12 bem-placa, dependendo do tamanho do tecido, ou em um microtubo de 1,5 ml. Se feito em chapa, parafilme para minimizar a exposição PFA. Vezes mais tempo de fixação pode resultar em mascaramento de antígenos, particularmente para o ACK-2 anticorpo anti-Kit.
- Remover o tecido da PFA e coloque em sacarose 30% em PBS. Permitir que o tecido a afundar durante a noite em 4 ° C.
- Equilibrar tecido com relação 1:1 de sacarose 30% e outubro por 1 hora. Então monte de tecidos verticalmente em cryomold cheia de outubro O eixo longitudinal do trato GI deve ser em paralelo com o cyrosections. Ao examinar os ratos com diferentes genótipos ou com diferentes tratamentos, pode ser útil para a montagem de tecido de ratos em diferentes cryomold mesmo para assegurar o processamento paralelo. Congelamento de gelo seco e colocar em freezer -80 ° C para armazenamento.
- Corte de 10 mM criosecçõesem slide e armazenar a -80 ° C freezer. Nós normalmente cortadas por duas seções de slides. Também costumam fazer H & E de coloração de uma lâmina cryosection.
- Para imunofluorescência, primeiro deslize equilibrar à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, desenhar círculo em torno do tecido usando caneta PAP.
- Bloco com 150 mL de tampão de bloqueio (o mesmo que para a imunocoloração montar todo) por 1 hora.
- Aspirar tampão de bloqueio e adicionar 150 mL de anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio e incubar overnight a 4 ° C em câmara úmida.
- Lavar 5 min 2x com PBS.
- Incubar com anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio por 2 horas em temperatura ambiente. Normalmente usamos Alexa 488 anti-coelho e Alexa 594 anti-rato anticorpos.
- Lavar por 15 min 3X com PBS.
- Aspirar slide sem secagem total do tecido. Adicionar uma gota de set difícil de montagem de mídia com DAPI (usamos Prolong Gold) e coloque # 1.5 lamela. Slides lugar à temperatura ambiente durante a noite para definir e armazenar em freezer -80 C °.
- Adquirir triple imagens de fluorescência usando DAPI, FITC, e define Texas Red filtro.
4. Resultados representativos:
Aqui, usamos o intestino grosso como um exemplo. H & E mancha de sacarose protegida fixa de congelação utilizado para imunofluorescência mostra alguns artefatos em comparação com uma seção de parafina de referência (Figura 2), onde a linha amarela demarks do plexo mioentérico entre as camadas musculares circular e longitudinal ea demarks linha verde na fronteira entre o mucosa e muscularlis. Examinando o cryosection, a partir da serosa a mucosa, você primeiro encontro da mais fina camada muscular longitudinal (LM), seguido do circular camada mais espessa do músculo (CM). A seção deve ser em paralelo com o músculo longitudinal para os núcleos de LM deve ser um pouco alongados, enquanto os núcleos do CM deve ser pequeno e redondo. Entre o LM e CM são plexi mioentéricos feito de neurônios que mancha com Pgp9.5. Pgp9.5 também processa manchas neuronal durante todo o CM. A rede mioentéricos ICC (ICC-MY) cercam o plexo mientérico e são feitos de células multipolar. Dentro da camada muscular longitudinal, há ICCs rara intramuscular (ICC-IMs), que são células bipolares operando em paralelo com o músculo. Dentro da camada muscular circular, existem abundantes ICC-IMs que também são células bipolares que correm paralelas com o músculo circular e são seccionadas transversalmente com este corte. Na junção dos muscularis e submucosa, a rede composta por submucosa ICC ICC-SMPs é uma rede fixa de ICCs multipolar. Examinando o Kit montar toda imunocoloração do intestino grosso, deve-se esperar encontrar o ICC-MY primeira rede, e então o ICC-IM do CM, e ICC-SMP redes, como uma foca da lamela (Figura. 3) . Medida volumétrica de redes ICC usando reconstrução 3D de toda montagem de imagens têm sido descritas 10. Usando wide-campo do microscópio, há fluorescência fora do plano significativa nas imagens-primas que podem ser removidos após a deconvolução (Figura 3). Incompleta stripping de mucosa irá resultar em alta fluorescência de fundo. ANO1 é outro marcador da ICC e co imunocoloração de KIT e ANO1 mostra sobreposição completa de ICC coloração (Figura 4).
Representante figura 1. Dissecados do trato gastrointestinal do rato, reimpresso com permissão 13.
Figura 2. A) Representante H & E coloração do intestino do rato grande de criosecções preparado como descrito e parafina referência incorporados secção que mostra alguns artefatos encolhimento de criosecções. O demarks linha amarela do plexo mioentérico ea linha azul separa a mucosa da muscularis. B) Representante Kit (vermelho, ACK-2) e Pgp9.5 (verde) imunofluorescência dupla com DAPI contracoloração (azul) do intestino de rato grande. LM: CM muscular longitudinal: músculo circular. Barra de escala 20 mM.
Figura 3. Representante Kit (vermelho, ACK-2) imunofluorescência toda montagem do mesmo campo em três planos focais, o ICC-MY avião na fronteira LM / CM, o avião ICC-IM na CM, e-ICC SMP avião na fronteira CM / submucosa. Imagens brutas e imagens deconvoluídos são mostrados. Barra de escala 20 mM.
Figura 4. Representante dupla imunofluorescência de Ano1 (verde) e Kit (vermelho, ACK-2) no intestino grosso. Barra de escala 20 mM.
Discussion
Células intersticiais de Cajal foram inicialmente caracterizados por Santiago Ramóón y Cajal exatamente um século atrás com manchas de azul de metileno e prata cromato de muscularis gastrointestinal. Cajal inicialmente pensado ICC foram neurônios com base em seus processos que são uma reminiscência de axônios e dendritos. Ao longo de muitos anos que se seguiram, o estudo da biologia ICC tem sido limitada pela falta de marcadores específicos, até a descoberta de que o KIT não só se expressa no ICC, mas também é necessário para o seu desenvolvimento 6. Desde então, KIT imunofluorescência tem sido amplamente utilizada no estudo da biologia e ICC também levou à valorização do ICC em outros órgãos contráteis, como a bexiga urinária. Recentemente, ANO1 tem sido identificada como um marcador ICC segundo confiável.
Houve inúmeras publicações nos últimos 15 anos através de imunofluorescência para identificar ICC usando vários fixação e técnicas de montagem. Em nossas mãos "fixed-congelados" criosecções que foram prefixados com paraformaldeído e sacarose protegidos funciona melhor em comparação com acetona ou paraformaldeído pós-fixação após cryosectioning. Para montagens todo, descobrimos que a fixação acetona seguido de dissecção da mucosa dá os resultados mais robustos.
Historicamente, o ACK-2 foi o anticorpo Kit de escolha para mouse ICC identificação. É um rato monoclonal que reconhece o domínio extracelular e é também um anticorpo de bloqueio que faz com íleo quando administrado a ratos vivem. No entanto, o epítopo ACK-2 é lentamente destruída pela fixação paraformaldeído e não é resgatado por métodos de recuperação padrão antígeno. Descobrimos que o epítopo ACK-4 é mais resistente à fixação paraformaldeído. Em comparação com fixo blocos congelados e seções, blocos parafinados e seções preserva a morfologia melhor e é mais fácil de longo prazo de arquivamento (Figura 4). Nem ACK-2 nem ACK-4 tem sido utilizado com sucesso em seções de parafina. Temos que caracteriza D13A2, um anticorpo monoclonal de coelho nova, funciona muito bem em ambas as seções fixas congelado e parafina do trato gastrointestinal.
Kit é expressa em vários outros tipos de células, incluindo os melanócitos, células hematopoiéticas, células germinativas, e em particular que os mastócitos também são encontrados no trato gastrointestinal. Felizmente, a maioria das células são encontradas mastro é a mucosa e não na muscularis. Coloração dupla com coelho anti-rato Ano1 e anti-Kit pode eliminar coloração não específica de cada anticorpo (Figura 4). É importante notar também que a expressão relativa do Kit e Ano1 entre subclasses de ICC parece diferente. Por exemplo, no intestino delgado, coloração Kit é muito mais intensa no ICC mioentéricos em comparação com ICC das profundezas do plexo muscular enquanto Ano1 coloração é comparável.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Cancer Institute (K08CA140946, para YC), (5F32CA130372, para PC), (R01CA102774 e R01HL055748 a PB), o Departamento de Defesa (PC094302 para YC), o Fundo de Pesquisa da Família Shuman GIST (para PC), eo Consórcio Cancer Starr (para PC, YC, CLS e PB). Gostaríamos de agradecer a Katia Manova, Fan Ning, e Mesurh Turkekul da instalação do núcleo Molecular Citologia MSKCC para ajudar com cryosectioning e imunomarcação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-2) | eBioscience | 14-1172 | Use at 2μg/ml. Epitope is lost with overfixation. |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-4) | Cedarlane Labs | CL8936AP | Use at 2μg/ml. |
| rabbit anti-KIT antibody (clone D13A2) | Cell Signaling Technology | 3074 | Use at 1:100 dilution. Only antibody listed here that works well in paraffin sections. |
| rabbit anti-Pgp9.5 antibody | Abcam | ab10404 | Labels neuronal cell cytoplasm. Useful for marking neurons of the myenteric plexus. Use at 1:1000 dilution. |
| rabbit anti-Ano1 antibody | Abcam | ab53212 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rat IgG | Invitrogen | A-11007 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11008 | Use at 2μg/ml |
| Animal Feeding Needle | Fisher Scientific | 01-208-87 | Silicon tipped needle useful for flushing GI tract of adult mice |
| Blunt Needle | BD Biosciences | 305180 | Blunt needle useful for flushing GI tract of pre-weaned pups |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | May use alternative hard-setting mounting media with DAPI |
| Tissue-Tek Cryomold | Tissue-Tek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Tissue-Tek | 4583 | |
| 32% Paraformaldehyde (10ml sealed ampoule) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Open sealed ampoule and dilute to 4% just before use |
| Blocking buffer | 5% Goat serum, 0.1% Triton X-100 in PBS |
References
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