Использование количественной ПЦР, мы показали, как устоявшихся куриных CAM модель может быть использована для количественного анализа метастазирование опухолевых клеток человека в отдаленные органы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественный анализ рака метастазы использовании Птичий Модель эмбрионов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В клетках метастазов рака распространения от первичной опухоли, вторгнуться в окружающие ткани, и распространился на отдаленные органы. Метастазы сложный процесс, который может включать в себя многие виды тканей, диапазон различных периодов времени, и часто происходят глубоко внутри органов, что затрудняет расследование и количественно. Кроме того, эффективность метастатического процесса находится под влиянием нескольких этапов метастатического каскада, что затрудняет оценку вклада отдельного аспекта поведения опухолевых клеток. Как следствие, метастазы анализах часто выполняются в экспериментах на животных, чтобы обеспечить реалистичный обязательно контекст, в котором для изучения метастазов. К сожалению, эти модели еще более осложняется их комплексного физиологии. Куриного эмбриона является уникальным в естественных условиях модель, которая позволяет преодолеть многие ограничения к изучению метастазы, из-за доступности chorioallantoic мембраны (CAM), хорошо васкуляризированной экстра-эмбриональные ткани, расположенной под яичной скорлупы, которая восприимчива к xenografting опухолевых клеток (рис. 1). Более того, поскольку куриного эмбриона естественно иммунодефицитом, CAM с готовностью поддерживает приживление нормальных и опухолевых тканей. Самое главное, птичий CAM успешно поддерживает большинство раковых клеток характеристики, включая рост, инвазию, ангиогенез, и реконструкция микроокружения. Это делает модель исключительно полезными для исследования путей, которые приводят к раку метастазов и предсказать ответ метастатического рака с новыми потенциальными терапии. Обнаружение распространены клеток видоспецифические Алу ПЦР позволяет количественно оценивать метастазы в органах, которые колонизировали всего лишь 25 клеток. Использование прав Эпидермоидная клеточной линии карциномы (HEp3) мы используем эту модель для анализа спонтанного метастазирования раковых клеток в отдаленные органы, включая печень цыпленка и легких. Кроме того, использование Alu-PCR протокола мы демонстрируем чувствительность и воспроизводимость анализа в качестве инструмента для анализа и количественного intravasation, арест, кровоизлияние, и колонизации в качестве отдельных элементов метастазов.
Протокол
1. Подготовка яйца xenografting (спонтанное метастазирование)
- Только что заложен оплодотворенных куриных яиц инкубируют во вращающейся инкубаторе в течение 10 дней при температуре 100 ° С и влажности 60%. Яйца вращаются четыре раза в час.
- На 10-й день развития яйца находятся на их стороне в яйце стойку. Гусиная шея лампу или другой подходящий источник света используется для свечи яйца сияющий свет в яичной скорлупы на тупой конец яйца, где airsac находится.
- Chorioallantoic вены расположены и обозначены. Это вены находится в верхней части скорлупы, где она стыке нескольких крупных кровеносных сосудов. На этой точке ветвления кровеносных ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Куриных CAM был использован для десятилетий в качестве модельной системы для изучения различных аспектов биологии рака и метастатической прогрессии. Принцип оценки метастатической способности были проведены в этой модели с помощью различных групп, включая анализ покоя (Агирре Ghiso и др., 1999;. Оссовский и Рейх, 1983), ткани ремоделирования (Дерюгина и др., 2005;. Хана-Dantona . и др., 1999), а метастазов (Zijlstra и др., 2008;. Zijlstra и др., 2002).. Он продолжает оставать.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы хотим, чтобы признать, Tyson Foods Инк щедро предоставления оплодотворенных яиц. Шанна Арнольд сыграл важную роль во время съемок этого протокола. Trenis Палмер была поддержана Национальным институтом здоровья под Рут Л. Kirschstein Национальный исследовательский Service Award (F31 National Cancer Institute). Эта работа была частично поддержана CCSRI Грант № 700537 на ЛЗЕ и NIH / NCI грант № CA120711-01A1 и 01A1-CA120711 на AZ.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (необязательно) |
| 1X Дульбеко изменения Eagle Средняя (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Дульбеко фосфатно-солевом буфере (D-би-эс) (1X), жидких | Invitrogen | 14190250 | рН 7,4 |
| Трипсин, 0,05% (1X) с ЭДТА 4Na, жидких | Invitrogen | 25300054 | |
| Спортсмен выводном | Берри Хилл | 1550HA | Эти инкубаторы являются одними из наиболее доступными. Тем не менее, видео покажет различного оборудования. |
| Спортсмен инкубатор | Берри Хилл | 1502EA | |
| Ротационный инструмент Dremel | Dremel | ||
| Dremel отсечки колес нет. 36 | Dremel | 409 | |
| Портативный помощи пипетки | Рыболов | 1368115E | |
| Хлопок чаевые Аппликаторы | Рыболов | 23-400-001) | |
| Оплодотворенные яйца | Различный | Много различных поставщиков могут быть использованы. Яйца должны быть примерно 35-55 граммов. Кур, которые кладет их должно быть от 36 до 55-недельного возраста. | |
| Гемоцитометра | Хауссер Научные, VWR | 15170-090 | |
| Волоконно-оптический микроскоп осветитель | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 иглы | |||
| Экстракт зеленого SYBR-N-Amp тканей PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
Ссылки
- Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).
- Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
