Summary
Lentivirus sono un valido strumento di ricerca per esplorare la funzione del gene, tuttavia, i ricercatori potrebbero voler evitare la produzione di codifica lentivirus pantropic oncogeni noti o sospetti. In alternativa, vi presentiamo un protocollo più sicuro per l'utilizzo del lentivirus ecotropic su cellule umane modificate per esprimere la mSlc7a1 ecotropic recettore.
Abstract
Staminali tumorali e studi di biologia cellulare spesso richiedono trasduzione virale delle cellule umane con oncogeni noti o sospetti, sollevando problemi di sicurezza maggiori per il personale di laboratorio. Lentivirus Pantropic, come comunemente utilizzati VSV-G pseudotype, sono uno strumento prezioso per studiare la funzione del gene perché possono trasdurre molti tipi di cellule, comprese le cellule non si dividono. Tuttavia, i ricercatori potrebbero voler evitare la produzione e la centrifugazione di virus oncogeni pantropic codifica per esigenze di più alto livello la gestione di biosicurezza e le questioni di sicurezza. Diversi oncogeni potenti, tra cui c-Myc e SV40 T antigene di grandi dimensioni, sono noti per aumentare la produzione di cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC). Tutti gli altri noti cambiamenti genetici che inducono IPSC (Oct4, Sox2, Klf4, Nanog, LIN28, e la perdita della funzione di p53) hanno anche i link al cancro, che li rende di preoccupazione per la sicurezza relativamente elevata.
Anche se questi tumori correlati virus sono utili per studiare la riprogrammazione cellulare e pluripotenza, devono essere usati in modo sicuro. Per affrontare questi problemi di biosicurezza, abbiamo dimostrato un metodo per la trasduzione di cellule umane con lentivirus ecotropic, con enfasi sulla riduzione dei costi e gestione conveniente. Abbiamo prodotto lentivirus ecotropic con titolo sufficientemente elevato per trasdurre superiore al 90% del esprimono i recettori delle cellule umane esposte al virus, convalidando l'efficacia di questo approccio.
Lentivirus è spesso concentrata per ultracentrifugazione, tuttavia, questo processo richiede diverse ore e può produrre aerosol infettivi a uomo ricercatori biomedici. In alternativa, le particelle virali possono essere più sicuro sedimentano sulla cellule per complessazione con solfato di condroitina e polibrene (CS / PB). Questa tecnica aumenta il titolo funzionale virale fino a 3 volte nelle cellule che esprimono stabilmente recettore retrovirus murino, con trascurabili tempo aggiunto e costo. Trasduzione di fibroblasti cutanei umani (HDFS) è al massimo migliorata utilizzando CS / PB concentrazioni di circa 4 volte inferiore al valore ottimale riportato in precedenza per le linee di cellule tumorali, suggerendo che la concentrazione polimero deve essere titolato per il tipo di destinazione delle cellule di interesse. Abbiamo quindi descritto l'uso di methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio bromuro (MTT) al dosaggio per la tossicità dei polimeri in un nuovo tipo di cellula. Osserviamo vitalità equivalente di HDFS dopo trasduzione virale utilizzando complessazione polimero o la dose standard di polibrene (PB, 6 mg / ml), con l'indicazione minima tossicità acuta.
In questo protocollo, si descrive l'utilizzo di lentivirus ecotropic per la sovraespressione di oncogeni nelle cellule umane, riducendo i rischi di biosicurezza e l'aumento del tasso di trasduzione. Abbiamo anche dimostrare l'uso di complessazione polimero per migliorare la trasduzione, evitando di aerosol centrifugazione formazione di particelle virali.
Discussion
Ricombinante gammaretrovirus ecotropic basato sul virus della leucemia murina Moloney (MLV) e il suo recettore mSlc7a1 sono ben studiati e ampiamente disponibili, siano stati utilizzati per oltre 20 anni per fornire transgeni alle cellule murine. Gammaretrovirus Ecotropic è stato usato più di recente per fornire oncogeni alle cellule umane;. Nell'ambito della riprogrammazione cellulare, l'uso di mSlc7a1 per evitare la generazione di virus oncogeni amphotropic ospitare umano è ben consolidata 4,5 Tuttavia, lentivirus offre vantaggi significativi rispetto gammaretrovirus nella trasduzione popolazioni di cellule refrattario, compresi 6 celle primarie, che sono spesso obiettivi auspicabili per la riprogrammazione, in quanto il lentivirale pre-integrazione di trasduzione del complesso permette di non dividere le celle 7.
Lentivirus sono state prodotte con decine di pseudotypes diversi, tra cui MLV, nel tentativo di alterare tropismo del virus, la tossicità, e altre proprietà. 8 MLV-pseudotyped lentivirus ecotropic è stato utilizzato per trasdurre cellule di topo, 9 ma raramente è stato utilizzato su cellule umane 10. Proponiamo quindi l'uso di MLV-pseudotyped lentivirus ecotropic come un veicolo sicuro, conveniente e altamente efficiente per fornire oncogeni noti o sospetti, tra cui i fattori di riprogrammazione cellulare, alle cellule umane.
È fondamentale notare che questo protocollo non del tutto elimina la necessità di produrre e utilizzare lentivirus pantropic, anzi, questo protocollo separa l'oncogene (s) dal virus pantropic, isolante ricercatori potenziale di auto-inoculazione con cancro-correlata virus. Il mSlc7a1 proteina e il suo omologo umano hSlc7a1 sono espresse ubiquitariamente trasportatori di aminoacidi senza tumorigenicità note o la capacità di conferire un vantaggio selettivo di crescita su cellule riceventi, 11 mSlc7a1 realizzazione di rischio relativamente basso per incorporazione in amphotropic virus. Questo passo ha aggiunto può essere particolarmente utile nei laboratori privi di virus o strutture dedicate coltura dei tessuti del livello richiesto biosicurezza.
In alcune situazioni può essere possibile eliminare completamente l'uso di virus pantropic dalla trasfezione del plasmide Slc7a1 direttamente nelle cellule bersaglio, tuttavia, molte cellule che sarebbe utile obiettivi di questa tecnica sono refrattari alla trasfezione. In alternativa, la capacità di isolare Slc7a1-trasdotte dalla selezione blasticidin significa che VSV-G lentivirus pseudotyped può essere utilizzato una sola volta per generare uno stock di cellule che esprimono recettori, dopo di che virus ecotropic può essere utilizzato di routine per trasdurre queste cellule per molti esperimenti. I ricercatori dovrebbero sempre seguire le loro linee guida di sicurezza istituzionali per lavorare con qualsiasi lentivirus, indipendentemente dal suo tropismo.
I titoli del virus ecotropic ottenuti con questo protocollo sono moderatamente inferiori VSV-pseudotyped virus, in genere il 10-20% del titolo virus pantropic, in accordo con precedenti studi. 9 Questi titoli sono stati misurati in cellule umane trasdotte stabilmente con Slc7a1, in modo che il minore titolo osservato per ecotropic virus può essere in parte a causa di variegata espressione del gene del recettore nelle cellule bersaglio. Tuttavia, la titoli virale raggiunto nel nostro protocollo sono più che sufficienti per la maggior parte delle applicazioni e portare alla trasduzione della maggior parte delle cellule, in alcuni casi> 90% delle cellule.
Centrifugazione basati su tecniche sono comunemente utilizzati per concentrare le particelle virali. Tuttavia, centrifugazione richiede diverse ore, genera aerosol infettivi, e può causare una perdita significativa di particelle virali. 12 In alternativa, la complessazione con CS / PB può essere usato per migliorare la trasduzione senza alterare tropismo virale. 3 Questo metodo è rapido (5 minuti ) e poco costoso (0,03 dollari per 10 ml di virus), mentre circa triplicando il titolo osservato. Non occorrono attrezzature o reagenti proprietari sono tenuti, e abbiamo osservato minima tossicità acuta dopo l'esposizione di HDFS di CS / PB, in accordo con precedenti lavori in altre linee cellulari. 13 Un potenziale svantaggio di questo protocollo è che alcuni complessi microscopicamente visibili polimero aderire le cellule per diversi giorni in coltura. Non possiamo escludere la possibilità che questi complessi, anche se non apertamente tossico per le cellule, possono avere effetti più sottili sui processi cellulari.
Qui abbiamo descritto una metodologia per la sicura ed efficiente trasduzione cellule umane con fattori oncogenici. Questo approccio dovrebbe essere di grande utilità per i ricercatori che studiano oncogeni e biologia delle cellule staminali comprese le cellule iPS.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il finanziamento per questo progetto è stato fornito dal California Institute per la Medicina Rigenerativa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pLenti6/UbC/mSlc7a1 | Addgene | 17224 | Murine MLV receptor |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | VSV-G envelope |
| pCMV-dR8.91 | Addgene | D. Trono lab14
Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260) |
|
| pHCMV-Ec–nv | Addgene | 15802 | Ecotropic envelope |
| FUGW | Addgene | 14883 | GFP control plasmid |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04 709 705 001 | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Blasticidin S | Fisher Scientific | BP 2647100 | |
| Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 |
References
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