Summary
Miljö bakterioplankton inkuberas med en modell som löst organiskt kol (DOC) förening och ett DNA-märkning reagens, bromodeoxyuridine (BrdU). Efteråt är DOC-nedbrytande celler skilda från huvuddelen gemenskapen som baseras på förhöjda BrdU införlivande med fluorescens aktiverad cell sortering (FACS). Dessa celler är sedan identifieras med efterföljande molekylära analyser.
Abstract
Mikroberna är stora aktörer förmedla nedbrytning av många löst organiskt kol (DOC) substrat i akvatiska miljöer. Dock innebär identifiering av bakterier taxa som omvandlar vissa pooler av DOC i naturen en teknisk utmaning.
Här beskriver vi ett arbetssätt som par bromodeoxyuridine (BrdU) bolagsordning, fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) och 16S rRNA gen-baserad molekylär analys som gör att kultur-oberoende identifiering av bakterioplankton kan förnedrande en specifik DOC förening i vattenmiljöer. Tre exemplar bakterioplankton mikrokosmos är konfigurerade för att ta emot både BrdU och en modell DOC förening (DOC ändringar), eller bara BrdU (no-tillägg kontroll). BrdU substitut positioner tymidin i nya syntetiseras bakterie-DNA och BrdU-märkt DNA kan lätt immunodetected 1,2. Genom en 24-timmars inkubation bakterioplankton som kan använda de extra DOC föreningen förväntas vara selektivt aktiveras, och därför har högre nivåer av BrdU bolagsordning (HI celler) än icke-känslig celler i DOC ändringar och celler i no- Förutom kontroller (låg BrdU införlivande celler, LI celler). Efter fluorescens immunodetection är HI celler urskiljas och fysiskt separerade från LI cellerna genom fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) 3. Sorterade DOC-känslig celler (HI celler) utvinns för DNA och taxonomiskt identifieras genom efterföljande 16S rRNA gen-analyser inklusive PCR, klon bibliotek konstruktion och sekvensering.
Protocol
1. Vattenprov bearbetning
- Filtrera 10L miljömässiga vatten genom 1 mikrometer-por-storlek membranfilter att ta bort större partiklar och bacteriovores. Samla upp vattnet filtratet i en Damejeanne.
- Överför 36 ml filtrat varje del i 3 sterila Eppendorf-rör (50 ml) innehållande 4 ml nygjord paraformaldehyd lösning (PFA, 10%). Inkubera i 2 timmar i rumstemperatur för att bevara celler. Samla cellerna på 0,22-ìm-por-storlek vit membranfilter av vakuumfiltrering. Tvätta filtret genom att passera 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom filtret genom vakuumfiltrering. Märk filter som negativa kontroller och förvara dem vid -20 ° C.
Steg är 1,3-1,4 tillval för upprättandet DOC-begränsade villkor.
- Tillsätt en blandning av oorganiska kväve och fosfor (5 mikroM NH 4 Cl, 5 mikroM NaNO 3 och 1μM NaH 2 PO 4 slutlig koncentration) i Damejeanne.
- Inkubera i mörker vid in situ temperatur under 48 timmar med enstaka agitationer.
2. Mikrokosmos etablering och inkubation
- Fyll var och en av sex 1-L glas flaskor med 800 ml vatten prov från Damejeanne i steg 1,4 för att upprätta mikrokosmos. Lägg BrdU (10 mikroM, slutlig koncentration) till varje mikrokosmos. Blanda väl.
- Tillsätt 1 ml modell DOC förening lösning i tre av mikrokosmos kommer dessa att fungera som DOC ändringar. Tillsätt 1 ml sterilt PBS i de tre återstående mikrokosmos, kommer dessa att fungera som ingen förutom kontroller.
- Inkubera alla mikrokosmos i en inkubator shaker och inkubera i mörker vid in situ temperatur under omskakning vid 100 rpm.
- Samla 36 ml vatten prov från varje mikrokosmos och överför till 50 ml sterilt Eppendorf-rör vid tidpunkterna 0, 8, 16 och 24 timmar. Tillsätt omedelbart 4 ml rent PFA (10%) för insamling rör och inkubera i 2 timmar i rumstemperatur för att bevara cellerna.
- Filtrera bevarade celler genom 0,22-ìm-por-storlek polykarbonatmembranfilter. Tvätta filtren med 10 ml PBS. Genast fortsätta till nästa steg eller förvara filtren vid -20 ° C.
3. In situ immunodetection för BrdU Bolagsbildning
- Tina filter (DOC ändras prover, ingen förutom kontroller och negativa kontroller) vid rumstemperatur.
- Applicera 1 ml av lysozym lösning [10 mg / ml lysozym äggvita i 100 mM Tris, 50 Nm EDTA (pH = 8)] 4 för att täcka bakterieceller på filtret. Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter. Tvätta filtret genom att passera 10 ml PBS igenom det under sug.
- Tillsätt 1 ml proteinas K-lösning [2 mg / ml proteinas K i 100 mM Tris, 50 Nm EDTA (pH = 8)] 4 för att täcka bakterieceller på filtret. Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter. Tvätta filtret genom att passera 10 ml PBS igenom det under sug.
- Tillsätt 1 ml exonuclease [exonuclease III (50 U / ml) i 5 mm MgCl 2 och 50 mM Tris-HCl] 5 för att täcka bakterieceller på filtret. Inkubera vid 37 ° C i 30 minuter. Tvätta filtret genom att passera 10 ml PBS igenom det under sug.
- Montera ramen tätning inkubation kammare (Bio-Rad) enligt tillverkarens anvisningar.
- Skiva filtret till åttondelar med en steril kniv på en rengjord alkohol-torr yta.
- Använd pincett, placera en åttonde del av ett filter till en monterad ram tätning inkubation kammare (åtta frame-tätning kammare behövs för varje filter prov). Den sida av filtret avsnitt som innehåller celler ska vara vänd uppåt. Fukten på baksidan av filtret gör att filtret fastna på bild. Om filtret är torrt, applicera en liten droppe (2 l) av diH 2 O i mitten av kammaren innan du placerar filtret avsnittet på bilden.
Steg 3,8-3,20 använda reagenser från Roche In Situ Cell Proliferation Kit FLUOS följande procedurer ändras från tillverkarens instruktioner. Med undantag för PBS är alla reagenser som tillhandahålls inom satsen.
- Applicera tillräckligt inkubation buffert (0,5% bovint äggvita, 0,1% Tween20 i PBS,) för att jämt täcka hela filtret avsnitt i inkuberingen kammare utan att svämma över när tätningen appliceras.
- Sätt ett lock polyester ram över inkubation kammare ram. Tryck ner ordentligt täta inkubation kammaren. Undvik luftbubblor ovanför filtret. Inkubera förseglad kammare i 10 min vid rumstemperatur i mörker.
- Ta bort polyester förseglingen och öppna inkubation kamrarna. (Obs: öppna kamrarna ibland kommer att dra upp ramen sigill från bilden i så fall förbereda en ny avdelning för de följande stegen..)
- Pipettera ut inkubationen buffert från ett hörn av kammaren. Undvik kontakt med filtret.
- Tvätta filtret genom att försiktigt pipettera 100 l PBS i ochut från kammaren 3 gånger.
- Förbered anti-BrdU-FLUOS fungerande lösning att följa stegen som rekommenderas av tillverkaren omedelbart före användning.
- Pipettera 120 l anti-BrdU-FLUOS fungerande lösning på filtret noga med att jämt täcka hela ytan.
- Täta kammare med en ny polyester lock. Undvik luftbubblor på toppen av filtret. Inkubera kammaren i mörker vid 37 ° C i 3 timmar. Detta steg kommer etiketten BrdU ingår DNA på plats med fluorescein (FITC).
- Ta bort polyester locket och öppna inkubation kammaren. Pipettera ut anti-BrdU-FLUOS fungerande lösning. Tvätta filtret 3 gånger med PBS.
- Överför filtret från inkubation kammaren till en steril yta. Skiva filtret avsnittet i små bitar med en steril kniv.
- Överför filtret bitarna i 2 ml mikrocentrifugrör, vardera innehållande 1 ml PBS. Hårt lock röret och tillslut parafilm. Inkubera vid 37 ° C och 200 rpm i 10 min.
- Fäst rören på en vortexer och skaka vid den högsta hastighet i 5 minuter. Pipettera av supernatanten i en steril 15 ml Eppendorf-rör. Upprepa inkubation och steg virvel i 5 gånger. Kombinera supernatanten i samma 15 ml Eppendorf-rör för varje prov. Normalt kan 80% celler återvinnas i suspensionen.
- Förvara supernatanten med återsuspenderade celler vid 4 ° C. Sortera inom 2 dagar.
4. FACS analys
Ett förfarande för en BD FACSAria flödescytometer och motsvarande programvara beskrivs här.
- Optimera inställningarna för följande flödescytometerns steg som rekommenderas av tillverkaren. Detta innebär: att justera förstärkningen för att ställa in önskad breakoff parametrar och sweet spot, optimera laser förseningen och området faktorer skalning för försöket skidan trycket och optimera inställningarna för FSC och SSC spänningar, FSC tröskel, FSC fluorescens skalning, fluorescens PMT etc.
- Kör negativa kontrollprov på flödescytometern (FCM) baserad på fluorescensintensitet av FITC och Side Scatter (SSC). Öka FITC tröskeln tills inga celler i de negativa kontrollerna kan visualiseras genom FITC-SSC förvärvet display.
- Kör ingen förutom kontrollprover och undersöka fördelningen mönstret på 10.000 celler baserat på FITC och SSC förvärv. Definiera en grind för att omsluta alla celler och utse dem som "lågintensiv celler" (LIS).
- Kör DOC-ändrade prover och undersöka fördelningen mönstret på 10.000 celler baserat på FITC och SSC. Vissa celler kommer att visas i den förinställda LI grinden. Definiera en port för att omsluta de celler som har högre fluorescensintensitet (HIS) än Lis. Förvärva statistik för att visa den relativa förekomsten av gated celler.
- Sortera HI celler till samling provrör innehållande 500 l PBS vid "rena 1 drop"-läge. Avsluta sortering när antalet av Hans når 500.000 räknas.
5. Filtrera PCR-amplifiering av 16S rRNA gener
Filtrera PCR-förfaranden ändras från Kirchman et al. 6
- Filtrera sorteras celler på en vit, 0,22 ìm-por-storlek, 25 mm diameter, polykarbonatmembranfilter. Klipp av kanten på filtret som inte innehåller några bakterieceller med en steril kniv. Skär i filtret i 8 lika stora bitar.
- Placera ett enda filter bit till en PCR-reaktion rör, med cellerna vetter in i röret. Tillsätt 45 l PCR-klass vatten i PCR-reaktionen röret. Sänk ner filtret helt och hållet i vattnet.
- Tillsätt 2 ROCHE Illustra PuReTaq Läs-To-Go PCR Pärlor i PCR-reaktionen röret, kort virvel. Tillsätt 2 l respektive framåt och bakåt 16S rRNA genen primers (0,4 mikroM slutlig koncentration för varje primer), såsom 27f och 1492R 7, i varje PCR-reaktion rören.
- (Valfritt) Lägg 1μl bovint serumalbumin lösning (BSA, slutlig koncentration är 30μg/100 l) till PCR-reaktionsblandningen att hjälpa adsorbera förstärkning hämmare. Om man väljer att inte lägga till BSA, lägga 1μl av vatten i stället.
- Utför PCR-amplifiering på apparaten. En touch ner PCR-programmet rekommenderas, som har det glödgning temperaturen sekventiellt minskade från 62 till 52 ° C med 1 ° C per cykel för 11 cykler, följt av 15 cykler med glödgning temperatur av 52 ° C. Alla cykler inkluderar denatureringen (vid 95 ° C), glödgning (vid 62 till 52 ° C) och extension (vid 72 ° C) steg 50s varaktighet. En första 3-min denaturering och sista 10-min förlängning steg ingår också i PCR-programmet.
- Bekräfta PCR-amplifiering med elektrofores på en etidiumbromid färgade 1% agarosgel. Excise PCR amplicons från gelen och rengör med QIAGEN QIAquick gelen utvinning kit.
- Utför ytterligare två PCR-förstärkningar för varje prov, varje gång använder ett nytt filter avsnitt. Efter PCR-gel purificatipå, sammanföra amplicons av samma prov tillsammans. Renat 16S rDNA amplicons är nu redo för ett antal molekylära analyser som gör taxonomiska identifiering, som klon bibliotek konstruktion och sekvensering.
6. Representativa resultat:
Representativa resultat beskrivs med en studie av Putrescine-nedbrytande bakterier som exempel. Vatten togs från en kustnära plats i Georgien och behandlas enligt de förfaranden som beskrivs ovan. FACS analys visade att Putrescine Dessutom framkallade utveckling av en grupp av bakterier med hög FITC fluorescensintensiteten, vilket indikerar hög BrdU Inblandningsgraden (Figur 1). Dessa celler har utsetts hög BrdU-upptagningsförmågan celler (HIS) och förväntades innehålla mestadels Putrescine-nedbrytande bakterier. Hans saknades i no-tillägg kontroller, som bara innehöll celler med lägre nivåer av BrdU bolagsordning (LIS). Lis förväntades främst innehåller bakterioplankton som inte kan använda läggas Putrescine. Hans sorterades in i separeras rör och sedan samlas in på membranfilter. 16S rRNA genen amplicons erhölls för hög HI celler med hjälp av filter PCR.
Figur 1. Flödescytometrianalyser av no-Förutom kontroll och modell-förening-ändringar (Putrescine som ett exempel här) prov som samlats in efter 24 h inkubation. Cell fördelning Analysen baserades på (1) fluorescensintensitet av FITC-märkning (x-axel), vilket är positivt relaterad till graden av BrdU bolagsordning, och (2) sidospridning (SSC, y-axel), vilket är positivt relaterad till cell storlek. Gate notation är baserad på graden av BrdU bolagsordning, (HI hög BrdU-bolagsordning, LI, låg BrdU-bolagsordningen). Den relativa andelen HI och LI celler visas i motsvarande grindar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår strategi par BrdU bolagsordning, FACS och 16S rDNA analys att tillåta arter nivå identifiering av bakterioplankton att metabolisera individuella DOC komponenter i vattenmiljöer. Den BrdU inbyggnad analys etiketter bakterieceller baserat på ämnesomsättning, vilket gör att analysen endast på aktiva bakterier och därför inte ingår vilande celler. I vårt tillvägagångssätt är BrdU ingå i situ immunodetected och bakterier som har olika nivåer av BrdU inbyggnad därefter visualiseras, grupperas och sorteras med hjälp av FACS. Analys av BrdU ingår celler har också rapporterats med hjälp av magnetiska pärla immunocapture av BrdU-märkta DNA följt av molekylära analyser 2,8,9. En begränsning av den senare metoden är dess oförmåga att skilja cellerna i olika aktivitetsnivåer. I så fall kommer analysen inkludera celler som finns kvar endast svagt aktiva genom att använda inhemska DOC i vattnet prover (Figur 1, LIS).
Det kopplade tillvägagångssätt har använts för att identifiera taxonomiska strukturer av bakterier som kan bryta ned DOC föreningar såsom dimethylsulfoniopropionate (DMSP), vanillate, glycin betain i kustnära havsvatten 3. Dess tillämpning kan grovt extrapoleras för att studera taxonomi av bakterier som använder andra isolerade eller blandade löst underlag i akvatiska miljöer. Förutom att 16S rRNA gener, kan funktionell gen markörer också på liknande sätt analyseras. Molekylär analys av sorterade celler är utmanande på grund av den lilla överflöd av sorterade celler, som normalt är mindre än 1 miljon celler. Därför är DNA-mall förstärkning normalt krävs för kompletterande molekylär analys. Även begränsade i cell kvantitet är tillräcklig upplösning av samhällsstrukturen oftast erhållas. Studier har visat att samhället fingeravtryck som genereras av terminalen begränsning fragment längd polymorfism (T-RFLP) från så lågt som 2000 celler (~ 1 l havsvatten) till stor del liknar de som genereras från 2x10 9 celler (~ 1 L havsvatten) i kustnära havsvatten 10. Förutom den enda genamplifiering med PCR, är metagenomic analys av sorterat celler möjligt genom en icke-PCR-genomisk förstärkningsteknik, nämligen flera förskjutning förstärkning, MDA 11.
Kritiska steg
För att upprätthålla förhållanden nära naturen, förutom av stora mängder av externa DOC föreningar för att mikrokosmos och långvarig inkubering bör undvikas. Preliminära experiment är starkt rekommenderat att fastställa den lägsta mängder av modell DOC föreningar som krävs för att inducera utvecklingen av HI celler i en relativt kort tid (<72 timmar). Längre inkubationstider kan höja oro för utvecklingen av flaskans-effekt i mikrokosmos. Pre-inkubering med oorganiskt kväve och fosfor är valfritt, men kan bidra till att förkorta längden på inkubationstid som krävs för utveckling av HI celler i DOC ändrade mikrokosmos.
Villkor för cell fixering innan BrdU fluorescens immunodetection är av avgörande betydelse. Otillräcklig fixering kommer att orsaka förlust av celler vid cellväggen permeabilization steg (lysozym och proteinas K behandlingar). Å andra sidan, över bevarade celler tenderar att vara alltför stelbent till Lyse och frigöra DNA-mall för filter-PCR-amplifiering. Val av konserveringsmedel, konserveringsmedel koncentration och bevarande tid längd bör vara optimerad för studeras bakteriell gemenskapen. Bevarande förfaranden som anges i detta protokoll har optimerats för ett kustnära marina bakterioplankton samhälle som till stor del domineras av Proteobacteria i alfa-och gamma-delområdena 10.
Flera steg av BrdU immunodetection utförs på membranfilter. Försiktighet bör vidtas för att undvika över torka filtren. Uttorkad celler över torkat filter kan starkt fästa till filtret membran och blir då svår att resuspendera för senare FACS analys. Cell av bakterier före och efter BrdU immunodetection bör alltid mätas för att bestämma återvinningsgraden av bakterieceller.
När man utför filter-PCR 6 bör volymen av PCR-reagens vara tillräckligt för att dränka filtret bit helt. En optimerad hot-start och touch-down PCR-program i allmänhet kan bidra till att producera bra genamplifiering. Ytterligare PCR-optimering kan utföras med hjälp av en PCR-optimering kit (som Epicentrum FailSafe PCR System) eller manipulera koncentrationer av Mg 2 +, BSA och andra ingredienser.
Metod begränsning
Detta kombinerat tillvägagångssätt gör det möjligt samling av bakterier som potentiellt kan försämra ett specifikt substrat och kan kultur-självständigt identifiera dessa funktionella celler till detaljerad taxonomiska nivåer. Dock bör flera aspekter tas i ACräkna när man tolkar resultaten. Den metod som initierar genom inkubering av naturliga bakterioplankton med specifika ämnen, vanligtvis på icke-spårämne nivåer i glasflaskor. Celler som identifierats som funktionell assemblage kan skilja sig från dem som behandlar given substans (er) under in situ förhållanden. BrdU införlivandet har visat sig vara omöjliga att upptäcka för en del bakterier 1,2. Dessa bakterier, därför är otillgängliga med denna metod. Bakterier som inte är direkt involverade i sammansatta nedbrytning men tar upp nedbrytningsprodukter tillsatt substans (er) kan ge falskt positiva signaler som är omöjlig att skilja från den verkliga degraders.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Finansieringen av detta projekt från National Science Foundation OCE1029607 (till XM) och MCB0702125 (till MAM) och Gordon och Betty Moore Foundation (till MAM).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BrdU | Reagent | Sigma-Aldrich | B5002-5G | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma-Aldrich | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagent | Sigma-Aldrich | P2308-25MG | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche Group | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
| Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | EMD Millipore | FALP14250 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | EMD Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | Qiagen | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | Epicentre Biotechnologies | FS99060 |
References
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).
- Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater. Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).
- Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).
- Dinjens, W. N. Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion. Histochemistry. 98, 199-199 (1992).
- Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR. Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).
- Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells. Science. 243, 1360-1360 (1989).
- Artursson, V., Jansson, J. K. Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).
- Mou, X. Z. Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean. Nature. 451, 708-708 (2008).
- Mou, X. Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).
- Dean, F. B. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).
