Summary
De intraluminale midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) model is de meest frequente gebruikte model onder experimentele ischemische beroerte modellen. Hier zullen we demonstreren het gehele model in detail met de gids van Laser Doppler flowmetry, en zijn vertegenwoordiger resultaten.
Abstract
Beroerte is de derde doodsoorzaak en de belangrijkste oorzaak van invaliditeit in de wereld, met een geschatte kost van bijna 70 miljard dollar in de Verenigde Staten in 2009 1,2. De intraluminale midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) model is ontwikkeld door vier Koizumi in 1986 aan deze indrukwekkende menselijke pathologie te simuleren in de rat. Een wijziging van de MCAO methode werd later door Longa 3. Beide technieken zijn op grote schaal gebruikt om de moleculaire mechanismen van hersenletsel als gevolg van ischemische beroerte en potentiële therapeutische modaliteiten 5 te identificeren. Deze relatief niet-invasieve methode bij ratten is uitgebreid om te gebruiken in muizen om te profiteren van transgene en knock-out stammen 6,7. Voor het modelleren van focale cerebrale ischemie, is een intraluminale hechtdraad geavanceerde via de interne halsslagader aan de basis van de MCA af te sluiten. Het terugtrekken van de hechting na een bepaalde periode nabootst spontane reperfusie, maar de hechting kan ook permanent worden bewaard. Deze video demonstreert de twee grote benaderingen voor het uitvoeren van intraluminale MCAO procedure bij muizen op een stapsgewijze manier, alsmede het verschaffen van inzichten voor potentiële nadelen en valkuilen. De ischemische hersenweefsel wordt vervolgens gekleurd door 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) om de mate van herseninfarct acht te evalueren.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Florida en is in overeenstemming met het "beginsel van Laboratory Animal Care" (NIH publicatie No 86-23, herzien 1985).
1. Materialen
- Dieren: Man C57BL / 6 muizen (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, USA) met een gewicht van 20-26 gram op het moment van de operatie.
- Anesthesie:
- Anesthesieapparaat: VetEquip inhalatie-anesthesie-systeem (VetEquip Inc, Pleasanton, CA, USA).
- Inhalatie: Isofluraan (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL).
- Chirurgische instrumenten: SuperCut Iris schaar, recht (World precisie-instrumenten, Inc, Sarasota, FL, Verenigde Staten); Vannas micro-schaar, recht (World precisie-instrumenten, Inc, Sarasota, FL, USA), Dumont pincet (fijne punt, 45 ° gebogen tips, World precisie-instrumenten, Inc, Sarasota, FL, USA), Bipolaire coagulatie-eenheid (High Frequency Exsiccator 900, World precisie-instrumenten, Inc, Sarasota, FL, USA); micro schip clip (World precisie-instrumenten, Inc, Sarasota, FL, USA)
- Chirurgisch materiaal: Steriel katoen tips, Wipes, Gaas sponzen; Suture (7-0 Silk hechtdraad, Ethicon, Inc, Somerville, NJ, USA); Tissue lijm (Vetbond, 3M Company, St. Paul, MN, USA); chirurgische scrub : Bethadine, 70% ethanol, en steriele 0,9% zoutoplossing, Eye zalf (Puralube Vet Zalf, Pharmaderm, Melville, NY, USA).
- Occlusie hechtdraad voorbereiding voor MCAO:
- Filament voor MCA occlusie: 7-0 chirurgische Nylon monofilament hechtmateriaal (Ethicon, Inc, Somerville, NJ, USA).
- Warmtebron voor afstomping hechtmateriaal tip (thermische cauterisatie Unit, World precisie-instrumenten, Inc, Sarasota, FL).
- Vloeibare siliconen rubber (Silicone RTV lijm, World precisie-instrumenten, Inc, Sarasota, FL, USA).
- Chirurgische / dissectiemicroscoop (Leica Stereo Microscope MZ6).
- Fiber optic verlichting (Fiber Optic verlichting FO1-150, TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA).
- Laser Doppler flowmetry (PeriFlux System 5000, Perimed, Stockholm, Zweden).
- Flexibele microtip (MT B500-0 Straight microtip, Perimed, Stockholm, Zweden)
- Temperatuur parameters:
- Rectale temperatuur monitor (BAT-12, World precisie-instrumenten, Inc, Sarasota, FL).
- Thermische deken (T / POMP, TP600, Gaymar, NY, USA).
- Vlekken en kwantitatieve meting van het volume infarct:
- 2%-oplossing 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (2% TTC, Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, USA).
- Muizen hersenen matrix snijmachine (Zivic-Miller Lab., Inc, Allison Park, PA, USA).
- Digitale camera (V1253, Kodak Co, Rochester, NY, USA).
- Afbeelding J-software (ImageJ 1.42q software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA).
2. Pre-operatieve stappen
- Voorafgaand aan de operatie, zijn de muizen zich onder een 12:12 licht / donker cyclus met vrije toegang tot water en knaagdieren chow.
- Hechtingen voor MCAO worden bereid door afstomping 1-2mm van de hechting tip met warmte en coating 3-4mm van hechtdraad as van de tip met vloeibare siliconen rubber, waardoor het droog (7-0, tip diameter, 0.20-0.25mm; coating lengte, 3-4mm; hechting lengte 11-13mm). Steriliteit moeten worden geconserveerd in alle van de bovengenoemde stappen.
- Na het wegen van de muis, is anesthesie geïnduceerd met 4% isofluraan in een inductie-kamer en in stand gehouden tijdens de procedure met 1,5-2% isofluraan bij 30% O 2 en 70% N 2 O gasmengsel via een gezichtsmasker.
- De muis is geplaatst in een buikligging op een gaasje liggend op een temperatuur-gecontroleerde bedienvlak (thermische deken), het hoofd vacht is geschoren.
- Smeermiddel oogzalf wordt toegepast op beide ogen en oogleden zijn gesloten om uitdroging te voorkomen dat het oog tijdens de chirurgische proces.
- Een middellijn incisie (1 cm) is gemaakt op de huid van de bovenliggende calvarium van een superieure nuchal lijn naar de nasion en de huid is getrokken zijdelings aan te brengen een flexibele microtip (MT B500-0 Straight microtip; 0,5 mm diameter). De microtip is loodrecht op het oppervlak van de rechter pariëtale schedel (1 mm posterior en 5 mm lateraal van de bregma) om de bloedstroom in de MCA grondgebied te controleren door een laser doppler flowmetry.
- Zorg ervoor dat de flexibele microtip is bevestigd stevig aan de schedel voordat het dier wordt aangezet om een liggende positie. Het dier de nek wordt geplaatst op een zachte pad en zijn neus wordt gehouden in de neuskegel van de anesthesie-apparatuur. Dit zal resulteren in het hebben van voldoende ruimte voor de flexibele microtip.
- Een rectale temperatuur sensor is aangesloten op een constante dier kerntemperatuur van 37 ± 0,5 ° C te houden
- Zowel de voorpoten en hindpaws zijn geplakt is aan de operationele platform oppervlak, en de staart is vastgebonden aan de rectale buis. </ Ol>
- Onder de operationele microscoop, is een middellijn hals incisie gemaakt met een schaar tussen de manubrium en de kaak door voorzichtig het opheffen van de losse huid.
- De gepaarde onderliggende submandibulaire klieren zijn ronduit verdeeld, met de linker klier links in situ. De juiste submandibulaire klier is craniaal teruggetrokken en vastgezet, samen met de m. sternocleidomastoideus.
- De blootgestelde verdeling van de omohyoid spier die de carotis schede wordt zorgvuldig verdeeld met pickups.
- De juiste gemeenschappelijke halsslagader (CCA) is zorgvuldig gescheiden en geïsoleerd van de nervus vagus en de schede (gelegen lateraal van CCA).
- Hierna, de twee chirurgische methoden die vaak gebruikt om MCA occlusie uit te voeren uiteen:
- Drie losse kraag hechtingen (7-0 zijde) zijn bereid om de juiste CCA.
- De externe halsslagader (ECA) wordt geïdentificeerd, geïsoleerd en dichtgeschroeid (2-3mm distaal ten opzichte van bifurcatie). Het kan vervolgens worden gedeeld met micro-schaar. Om te voorkomen dat per ongeluk schade aan de perifere cauterization site, moet het vermogen worden vastgesteld op 1 met de power-knop. Dit is consistent zijn voor alle cauterizations.
- Voldoende spanning wordt toegepast op de meest proximale kraag hechtdraad op de CCA om de bloedstroom (permanente ligatie) af te sluiten. De stroom occlusie wordt gecontroleerd door een ~ 50% daling van de uitgangswaarde corticale perfusie waarden.
- Dan is een schip clip wordt geplaatst net voor de CCA bifurcatie te retrograde luchtstroom te voorkomen op het moment van arteriotomie.
- Een arteriotomie wordt uitgevoerd tussen de proximale geligeerde hechting en het schip clip op de CCA met micro-schaar (dichter bij ligatie).
- De warmte-stomp siliconen gecoat nylon 7-0 hechtdraad wordt ingebracht via de arteriotomie en gevorderden tot het bereiken van het schip clip. De twee resterende losse kraag hechtingen worden voorzichtig vastgezet rond de CCA tussen de arteriotomie en het schip klem om te voorkomen dat terugstromen lekkage door CCA, met de nodige voorzichtigheid niet op de slagaderwand traumatiseren, dan is het schip klem wordt ingetrokken.
- De ECA is geïdentificeerd, ontleed zo veel mogelijk (in de buurt zijn bifurcatie in talen en maxillaire slagaders), dichtgeschroeid (met kracht ingesteld op 1), en verdeelde met micro-schaar.
- Twee losse kraag hechtingen (7-0 zijde) zijn bereid rond de proximale ICA net boven de CCA bifurcatie.
- De CCA is tijdelijk gesloten met een schip clip. De stroom occlusie wordt gecontroleerd door een ~ 50% daling van de uitgangswaarde corticale perfusie waarden.
- Dan is de ICA is tijdelijk gesloten met een clip vat boven de twee losse kraag hechtingen aan retrograde luchtstroom te voorkomen op het moment van arteriotomie.
- Een arteriotomie wordt uitgevoerd met behulp van micro-schaar in het gereflecteerde Rekenkamer de buurt van de stomp.
- De warmte-stomp siliconen gecoat nylon 7-0 hechtdraad wordt ingebracht via de arteriotomie in ECA en geavanceerde totdat het bij de toegepaste schip clip in ICA. De twee losse kraag hechtingen in de proximale ICA worden voorzichtig vastgezet rond de proximale ICA tot reflux bloedstroom te voorkomen door ICA, met voldoende aandacht niet op de slagaderwand traumatiseren, dan is het schip klem wordt ingetrokken.
- De afsluitende hechtdraad wordt langzaam vordert via interne halsslagader (ICA) in de richting van de schedel basis tot een milde weerstand voelt. Een gelijktijdige daling van de cerebrale doorbloeding waarde als een percentage (= 80%) ten opzichte van de uitgangswaarde wordt bevestigd door laser doppler flowmetry. De twee kraag hechtingen worden aangescherpt om de ingevoegde gloeidraad.
- Voor transiënte cerebrale ischemie experimenten, wordt de afsluitende hechtdraad voorzichtig ingetrokken na 45 minuten. Dit tijdstip kan worden gewijzigd voor verschillende experimentele doeleinden.
- Na de intrekking van de hechtdraad gloeidraad, is de arteriotomie website gesloten om post-operatieve bloeden te voorkomen. In de methode van Koizumi's, gaat het stevig aandraaien van de kraag hechtingen rond de CCA. In techniek Longa, het arteriotomie site op de voet van de Rekenkamer is verbrand, dan is de kraag hechtingen aan het proximale ICA zijn losgemaakt en verwijderd om de halsslagader te herstellen.
- Te sluiten van de incisie, de glandula submandibularis en SCM gelegd over het operatiegebied. De wondranden worden vervolgens benaderd met weefsel lijm in cervicale en plekken op de hoofdhuid. Als alternatief kan een resorbeerbaar garen of metalen nieten worden gebruikt om de wond vooral wanneer lange termijn overleving van het dier bestemd is dichtbij.
- Na de incisie sluiting, die het dier krijgt een warm ml zoutoplossing subcutaan, als het volume aanvullen. Een dosis van geschikte analgetica (dat wil zeggen Buprenorfine op 0.05-0.1 mg / kg) moet worden gebruikt om dieren pijn en ongemak te minimaliseren tijdens de herstelperiode. De animal wordt verwijderd uit de chirurgische suite en geplaatst in een warme verkoeverkamer / kooi om onderkoeling te voorkomen, met vrije en gemakkelijke toegang tot zacht voedsel en water.
- er geen waarneembare tekorten
- niet contralaterale voorpootje (mild focale neurologische tekort) uit te breiden
- cirkelen in een richting contralateraal van infarct (matige focale neurologische tekort)
- vallen in een richting contralateraal van infarct (ernstige focale neurologische tekort)
- verminderd bewustzijn, zonder spontane beweging
- Na 24 uur MCA reperfusie, is de overlevende muis gewogen, diep verdoofd met 4% isoflorane, en offerde volgens de goedgekeurde protocol.
- De hersenen zijn zorgvuldig verwijderd en geplaatst in een muizenhersenen matrix snijmachine, en het hele cerebrum is coronaalwaarts doorsnede van 2 mm intervallen.
- De secties worden ondergedompeld in 2% TTC in fosfaat zoutoplossing (PBS) gebufferde bij 37 ° C gedurende 20 minuten. Na TTC kleuring, is infracted gebied weergegeven als een wit (ongekleurd) weefsel grenzend aan rode baksteen (levensvatbare) weefsel (figuur 1).
- Seriële secties zijn gefotografeerd met een digitale camera en het gebied van het infarct wordt gemeten met de afbeelding J-programma.
- Het gebied van infarct (wit, onbesmet), op het gebied van ipsilaterale hemisfeer (witte en rode bakstenen, gekleurd), en het gebied van de contralaterale hemisfeer (rode baksteen, gebeitst) zijn gemeten voor elke sectie. Het volume wordt berekend door optelling van de representatieve gebieden in alle secties en te vermenigvuldigen met de slice dikte. Na correctie voor oedeem, is het volume van de infarct als volgt berekend 9:
Gecorrigeerd Infarct Volume (CIV),% = [contralaterale hemisfeer volume - (ipsilaterale hemisfeer volume - infarct volume)] / contralaterale hemisfeer volume x 100
3. MCA occlusie chirurgie:
Koizumi's 4 methode
Longa's 3-methode
De rest van de procedure is grotendeels convergerende:
4. Post-Op neurologisch onderzoek
Nadat het dier terug totale bewustzijn, kunnen neurologische stoornissen worden geëvalueerd door een eenvoudige schaal (vijf-punts schaal) als volgt 3:
5. Vlekken en kwantitatieve meting van de hersenen infarct volume
6. Representatieve resultaten
Na de occlusie en reperfusie van het MCA via links CCA aan voorbijgaande cerebrale ischemie vast te stellen, worden dieren geofferd en hun coronaalwaarts doorsnede hersenen zijn gekleurd met TTC om het volume van infarct (Figuur 1) te evalueren.
Figuur 1. TTC-lood serial coronale hersenen secties (2 mm) van muizen blootgesteld aan MCA occlusie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het MCAO model is een model dat vastgesteld cerebrale ischemie repliceert in muriene soorten. Dit model werd voor het eerst gebruikt in ratten en daarna aangepast aan de muizen. Het vermijden van craniectomy om de invloed van chirurgische manipulatie op de bloed-hersen barrière permeabiliteit en intracraniale druk te elimineren is een voordeel van deze techniek. Echter, veel variabelen, zoals de stam-gerelateerde verschillen 10, de grootte van hechtdraad tip 11, duur van de occlusie 6, lichaamstemperatuur 12, anesthesie 13, en andere factoren leiden tot een inconsistentie in het infarct volumes in dit model.
Er zijn specifieke technische details die vermelden bevel:
- Coating het einde van de hechting zal leiden tot een glad en beheersbaar hechtdraad voor occlusie van de MCA met een verminderd risico op perforatie.
- Delicaat aparte en veilige de nervus vagus van de aangrenzende slagaders dus het is niet per ongeluk beperkt in een kraag hechtdraad. Zorg ervoor dat u twee kraag hechtingen te gebruiken om retrograde bloeden te voorkomen door de arteriotomie, terwijl het bestijgen van de afsluitende hechtdraad en voorzichtig zet ze om te voorkomen dat traumatische de slagaderwand.
- De pterygopalatine slagader afwijkt van de ICA na CCA bifurcatie. Om te voorkomen dat afwijkende het topje van oplopende hechtdraad in de pterygopalatine slagader in plaats van de ICA, het instellen van uw chirurgische platform om de muis hoofd en de nek te houden in een rechte richting. Deze afwijking is voor beide Koizumi's en Longa's techniek, dus zorg moeten worden genomen in een van beide procedure.
- Laser Doppler flowmetry is een methode van real-time monitoring van de bloedstroom in de verschillende anatomische regio's, en wordt toegepast in ons experiment om de bloedstroom te meten op het gebied van de hersenen geleverd via MCA. Het verhoogt de nauwkeurigheid van hechtdraad positionering, en zorgt zo voor betrouwbare resultaten te verkrijgen. Dit is een bekende voordeel ten opzichte van minder nauwkeurige technieken van het meten van de lengte van de hechting in te voegen, dat gevoelig is voor de inmenging van anatomische variaties.
- Een tijdelijke verhoging van de laser-doppler flowmetry terwijl u uw hechtdraad door de CCA en ICA zorgt ervoor dat u zich verplaatst in de juiste richting en dicht bij het MCA ostium.
- De occipitale slagader meestal voort uit de proximale Rekenkamer (hoewel soms uit de ICA) in een posterolaterale richting. Er moet worden nagegaan (in afgebonden sommige gevallen) om later verwarring te voorkomen, terwijl het plaatsen van de hechtdraad.
- De variabiliteit van de infarct te verlagen, houdt de muis lichaamstemperatuur stabiel tijdens de operatie en vermijd hypothermie na de operatie.
- Gebruik TTC vlekken tot 72 uur na de ingreep MCAO voor het analyseren van het infarct volume behoren. Voor langere overlevingstijd punten gebruiken andere methoden, zoals vlekken cresyl violet vlekken op de infarctgrootte te bepalen.
| Koizumi's Method | Longa's Method | |
| Site van hechtdraad inbrengen | Ipsilaterale a. carotis communis | Ipsilaterale externe halsslagader |
| Permanente arteriële offer | Halsslagader en Externe halsslagaders | Externe halsslagader |
| Het risico van dodelijke intraoperatieve aderscheuringen / bloeding | Minder zorg | Grotere zorg |
| De mogelijkheid van hechtdraad afleiding in Pterygopalatine slagader | Ja | Ja |
| Procestermijn | Over het algemeen sneller | Het algemeen langer |
| Laser Doppler Flowmetry: daling in procenten ten opzichte van baseline | > = 80% | > = 80% |
| Laser Doppler Flowmetry: occlusie / reperfusie trend |
|
|
Tabel 1. Vergelijking van twee methoden van intraluminale midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) bij muizen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict te hebben.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Animal | Harlan Laboratories | 20-26 grs | |
| Dissection microscope | Microscope | Leica Microsystems | 6.3:1 zoom | |
| Fiber optic illuminator | Illuminator | TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA | FO1–-150 | |
| Isoflurane | Anesthesia | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| SuperCut Iris scissor, straight | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14218 | |
| Vannas micro-scissor, straight | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Dumont fine tip forceps | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 503290 | |
| Vessel clip | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14120 | |
| High Frequency Desiccator 900 | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 500397 | |
| 7-0 surgical Nylon monofilament suture | Suture | Ethicon Inc. | 1647G | Suture for occlusion |
| 7-0 surgical Silk suture | Suture | Ethicon Inc. | 7733G | Suture for ligation |
| Silicone RTV adhesive | Silicone rubber | World Precision Instruments, Inc. | 1571 | |
| Vetbond | Tissue adhesive | 3M | 70200746587 | |
| Puralube Vet Ointment | Eye ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Buprenorphine hydrochlorode | Analgesics | Hospira Inc. | NDC 0409-2012-32 | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, Inc. | 501292 | ||
| PeriFlux System 5000 | TCD flowmetry | Perimed | ||
| BAT-12 | Rectal thermometer | World Precision Instruments, Inc. | BAT-12R | |
| T/PUMP, TP600 | Thermal blanket | Gaymar Industries | ||
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Mice brain matrix slicer | Brain slicer | Zivic Instruments | BSMAS001-1 |
References
- Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).
- Lloyd-Jones, D. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, e21-e181 (2009).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurol Res. 19, 641-648 (1997).
- Fujii, M. Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 28, 1805-1810 (1997).
- Bederson, J. B. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17, 1304-1308 (1986).
- Qi, X., Hosoi, T., Okuma, Y., Kaneko, M., Nomura, Y. Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury. Mol Pharmacol. 66, 899-908 (2004).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).
- Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).
