Fluorescentie Lifetime Imaging (FLIM) heeft zich ontpopt als een belangrijke techniek om het imago van de omgeving en de interactie van specifieke eiwitten en kleurstoffen in levende cellen. FLIM van fluorescerende moleculaire rotoren laat in kaart brengen van de viscositeit in levende cellen.
Methodenartikel
Fluorescentie Lifetime Imaging voor Moleculaire Rotoren in levende cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Diffusie vaak een belangrijke snelheidsbepalende stap in chemische reacties of biologische processen een rol speelt in een breed scala van intracellulaire. Viscositeit is een van de belangrijkste parameters die van invloed van de diffusie van moleculen en eiwitten, en veranderingen in viscositeit in verband gebracht met ziekte en storingen op het cellulaire niveau. 1-3 Terwijl methoden om de viscositeit te meten bulk zijn goed ontwikkeld, imaging microviscosity blijft een uitdaging . Viscositeit kaarten van microscopische voorwerpen, zoals enkele cellen, tot voor kort waren moeilijk te verkrijgen. Mapping viscositeit met fluorescentietechnieken is voordelig omdat, vergelijkbaar met andere optische technieken is minimaal invasieve niet destructief en kan worden toegepast op levende cellen en weefsels.
TL-moleculaire rotoren vertonen fluorescentie levensduur en quantum opbrengsten die een functie van de viscositeit van hun micro-omgeving. 4,5 intramoleculaire verdraaien ofrotatie leidt tot niet-stralende verval van de aangeslagen toestand naar de grondtoestand. Een viskeuze omgeving vertraagt deze rotatie of het verdraaien, het beperken van de toegang tot deze niet-stralende verval route. Dit leidt tot een verhoging van de fluorescentie kwantumopbrengst en de fluorescentie levenstijd. Fluorescentie levensduur Imaging (FLIM) gemodificeerd hydrofobe BODIPY kleurstoffen als fluorescerende moleculaire rotors blijkt dat de fluorescentie levensduur van deze probes is een functie van de microviscosity van hun omgeving. 6-8 A logaritmische de fluorescentie levenstijd versus het oplosmiddel viscositeit opbrengst een rechte lijn die de Förster Hoffman vergelijking gehoorzaamt. 9 Dit perceel dient ook als een ijklijn te fluorescentielevensduur om te zetten in viscositeit.
Na de incubatie van levende cellen met de gewijzigde BODIPY fluorescerende moleculaire rotor wordt een punctata kleurstof verdeling waargenomen in de fluorescentie beelden. De viscositeit verkregen waarde the puncta in levende cellen is ongeveer 100 keer hoger dan die van water en van cellulair cytoplasma. 6,7 Tijdopgeloste fluorescentie anisotropie metingen rotatie-correlatie keer op in overeenstemming met deze grote microviscosity waarden. Het afbeelden van de fluorescentie levenstijd is onafhankelijk van de fluorescentie intensiteit, waardoor aldus de scheiding van probeconcentratie en viscositeit effecten.
Samengevat hebben we een praktische en veelzijdige benadering van de microviscosity in de cellen op basis van FLIM van fluorescerende moleculaire rotoren in kaart te brengen.
Protocol
De protocollen voor FLIM monstervoorbereiding niet verschillen van die voor confocale of wide-field intensiteit op basis van fluorescentie microscopie. De data acquisitie wordt gevolgd door de voornaamste taak van data-analyse, dat wil zeggen het extraheren van de fluorescentie levensduur van de ruwe data. Zodra deze zijn verkregen, data-interpretatie helpt om na te gaan of vervalsen hypothesen.
1. Aangekleurde cellen met moleculaire rotors
- Bereid een stock oplossing (10 ml) door het oplossen ongeveer 1 mg / ml van de kleurstof in een geschikt oplosmiddel (bijv. methanol BODIPY-C12) 6,7 met een nauwkeurige balans en een pipet.
- De cellen (model kankercellijn, HeLa in geval) gebeitst worden gekweekt op een plaat met een multiwell coverslide onderzijde van microscopie in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 atmosfeer tot ongeveer 80% confluent .
- Voeg 10 tot 20 ul van de stockoplossing van de levende cellen groeien in een multi-WELl plaat (SmartSlide 50 micro-incubatie systeem WaferGen) in 4 ml Opti-MEM medium (Gibco) per putje van een 6-wells plaat. Dit levert een micro-molaire kleurstof concentratie in de put.
- Breng de multi-wells plaat met een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 atmosfeer 10-45 minuten voor kleuring.
- Verwijder de multiwell plaat uit de incubator en was de cellen 3-4 keer met 4 ml optisch heldere celkweek medium (bijv. Opti-MEM) naar overtollige kleurstof te verwijderen.
- Breng de plaat meerdere venstertjes aan de microscoop podium en sluit met een temperatuurregelaar / 5% CO 2-gas inlaat zoals vereist, in voorbereiding voor de beeldvorming.
2. FLIM van fluorescerende moleculaire rotors in cellen
- Plaats het monster op de microscoop podium en het verkrijgen van een transmissie-en fluorescentie afbeelding om fluorescerende cellen te identificeren. Een schematisch diagram van de experimentele opstelling is weergegeven in Fig. 1.Verify dat de fluorescentie komt voort uit de locaties ervaCTED (bijv. celmembraan, cytoplasma). Neem een fluorescentie-emissie spectrum en controleren of deze is dat de kleurstof of eiwit verwacht, in dit geval het spectrum van de moleculaire rotor. Als negatieve controle beeld niet gekleurd monster controleren dat niet fluoresceren. Hoewel deze stap is niet noodzakelijk specifiek voor FLIM, het is een goede gewoonte in het algemeen en helpt om te controleren of de steekproef is wat je denkt dat het is.
- Schakel over naar FLIM mode - dit is eenvoudig te realiseren door het verplaatsen van een spiegel uit de fluorescentie detectie stralengang ("externe detector" knop op "stralengang instelling" paneel aan de Leica TCS SP2 overname besturingssoftware). Een passende fluorescentie-emissie-filter voor een spannende licht van het bereiken van de melder te blokkeren moet in de fluorescentie detectie beampath.
Figuur 1. Experimentele regeling voor tijd-domein FLIM gebruikmakend van wisselstroomonfocal laser scanning microscoop.
- Scan het monster en te controleren, op de computer regelen van de FLIM overname, dat de detector telsnelheid (zwarte balk het label CFD bij overname besturingssoftware van de Becker & Hickl SPC 830 bord) is niet meer dan ongeveer 1% van de laser herhalingsfrequentie ( groene balk het label SYNC overname besturingssoftware). Als het, verlaag dan de laser excitatie-intensiteit, bijvoorbeeld door het plaatsen van een neutrale dichtheid filter in de laserstraal pad, om te voorkomen dat het verzamelen van pile-up vervormde fluorescentie verval bochten.
- Het verwerven van een FLIM beeld, typisch voor 3-5 minuten, stop scannen en besparen zij de ruwe gegevens (een 3D-data "kubus", bestaande uit ruimtelijke coördinaten x en y, en tijd).
- Open de ruwe gegevens in de fluorescentie verval analyse software pakket, bv TRI-2 14 of commerciële software, om de fluorescentie-intensiteit beeld weer te geven. Dit is gewoon de geïntegreerde fluorescentie verval, dat wil zeggen het gebied onder de fluorescentie verval curve, in elkepixel.
- Selecteer een typisch pixel door het plaatsen van de cursor er op en inspecteer de fluorescentie verval in die pixel. Als de piek telling onder de 100, gebruik maken van ruimtelijke binning van pixels. De tellingen van aangrenzende pixels (bijvoorbeeld 3x3 of 5x5) toegevoegd in de centrale pixel, zodat een hogere maximale aantal verkrijgt men. Dit levert een hogere statistische nauwkeurigheid voor de volgende stap. Als alternatief kan de meting herhaald voor een langere acquisitietijd (stap 5). Voor de 30-50min, is een ongeveer 10 maal hogere piek count (en totale tellingen) verkregen, maar dit is veel te lang een overname voor de meeste biologische monsters vanwege het gevaar van de invoering van artefacten als gevolg van steekproef beweging, microscoop drift, fototoxiciteit en fotobleken.
- Selecteer een globale pixel drempelwaarde (waarboven het verval in een pixel wordt gemonteerd) en een keer met een exponentiële verval fit op de afbeelding. Het resultaat levert een fluorescentie levensduur voor elke pixel dan de drempelwaarde, die vervolgens wordt gecodeerdkleur. Elke pixel is gekleurd met het resultaat van de pasvorm en FLIM kaart wordt verkregen. Controleer de verminderde chi-kwadraat-waarden voor verschillende pixels - ongeveer 1 (en tot 1,3) geeft een goede pasvorm. Inspecteer de bijbehorende restmaterialen, die willekeurig verdeeld moeten worden rond de nul.
- De fluorescentie levensduur histogram plots hoe vaak bepaalde fluorescentie levens optreden ten opzichte van de fluorescentie levensduur zelf. Stel het kleurbereik zodanig dat de fluorescentie levensduurverdeling past in het kleurbereik.
- Als monoexponential fit levert geen chi-kwadraat van ongeveer 1 (en tot 1,3) en er een systematische afwijkingen van de residuen van nul, is een meer geavanceerde model nodig. Bijvoorbeeld proberen aanbrengen van een dubbele exponentiële model om de fluorescentie vervalt, in verband twee verschillende omgevingen de sonde kan inch De aanpassing tevens de pre-exponentiële factoren of amplitudes die een indicatie van de relatieve hoeveelheid kleurstof geven een opbrengst milieument of het ander. Als alternatief kan een gestrekte exponentiële functie geschikt om te corrigeren voor een verdeling van fluorescentie levensduur.
- De resultaten voor de fluorescentie levensduur, pre-exponentiële factoren en de levensduur verhouding en de pre-exponentiële factor verhouding per pixel kan dan worden gecodeerd in kleur. Elke pixel is gekleurd volgens haar waarde, en het contrast als gevolg van fluorescentie levens, pre-exponentiële factoren en hun ratio's wordt verkregen. Wederom, zie de gereduceerde chi-kwadraat waarden (die ook kan worden gecodeerd in kleur en weergegeven als een afbeelding) - rond 1 (en tot en met 1.3) geeft een goede pasvorm. Controleer de residuen die willekeurig te verdelen rond nul.
- Fluorescentielevensduur histogrammen moet vergezeld gaan van alle beelden voor eenvoudige visualisatie van de gemiddelde fluorescentie levensduur waarden, en de fluorescentie levensduur distributie.
3. Representatieve resultaten
Fluorescentie vervalt gemeten voorde fluorescerende moleculaire rotor bij toenemende viscositeit in methanol / glycerol mengsels zijn weergegeven in Fig. 2. De fluorescentie vervalt zijn monoexponential en de fluorescentie levenstijd varieert aanzienlijk als functie van de viscositeit. Het stijgt van ongeveer 300 ps in methanol (viscositeit 0,6 cP) naar 3,4 ns in 95% glycerol (viscositeit 950 cP).
Figuur 2. Fluorescentievervaltijd profielen BODIPY-C 12 methanol / glycerol mengsels van verschillende viscositeit. 6
De logaritmische ijkcurve van fluorescentie levensduur τ versus viscositeit η de fluorescerende moleculaire rotor is weergegeven in Fig. 3. Het is een rechte lijn zoals gevraagd door de Förster Hoffman vergelijking 9
waarbij k 0 de radiative snelheidsconstante en z en x constanten, met 0
waarbij x de helling van de rechte lijn.
Figuur 3. Een perceel van log fluorescentie levensduur versus log viscositeit voor BODIPY-C 12 levert een rechte lijn in overeenstemming met de Förster-Hoffmann vergelijking 6.
Na de incubatie van levende cellen met de fluorescerende moleculaire rotor een punctata kleurstof verdeling wordt waargenomen in de fluorescentie beelden. FLIM beelden van HeLa-cellen geïncubeerd met een meso-gesubstitueerde BODIPY kleurstof worden getoond in Fig. 4. De fluorescentie vervalt in elke pixel van het beeld voldoende kan worden uitgerust met een enkele exponentiële verval model.
Figuur 4. (A) fluorescentie-intensiteit en (b) FLIM beelden van HeLa cellen gekleurd met BODIPY-C 12. De lichte, puntlaesies regio's vertonen een kortere levensduur dan andere regio's. Deze kortere liftime overeen met een lagere viscositeit in het puncta waarschijnlijk vetdruppels volgens de Förster-Hoffmann vergelijking.
Getrokken waarbij de levensduur uit elke pixel, verkrijgt men een fluorescentie levensduur histogram van het gehele beeld zoals getoond in Fig. 5.
Figuur 5. Histogrammen van fluorescentie levensduur van FLIM beelden van HeLa-cellen gekleurd met meso-gesubstitueerde BODIPY moleculaire rotoren.
Discussie
FLIM biedt een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van de intensiteit op basis van fluorescentie beeldvorming. Het kunnen over fotofysische gebeurtenissen of moeilijk waar te nemen door fluorescentie beeldvorming, omdat het scheiden van fluorofoor concentratie effecten. Dit is vooral handig voor het in kaart brengen van intracellulaire viscositeit door beeldvorming fluorescerende moleculaire rotoren. De fluorescentie levenstijd kan gemakkelijk worden omgezet in een viscositeit met een ijkgrafiek, zoals getoond in Fig. 3 onafhankelijk van de concentratie van fluorescerende moleculaire rotors.
In FLIM kunnen er artefacten die data-interpretatie kunnen bemoeilijken. 10 Instrumental artefacten zijn verstrooid licht dat zal verschijnen als een piek op de top van het begin van de fluorescentie verval en kan worden verward met een korte decay tijd, of een kleine piek na de IRF die kan worden veroorzaakt door reflecties in de microscoop. Deze strooilicht artefacten kunnen worden geïdentificeerd als zodanigomdat ze kunnen worden onderscheiden met spectrale discriminatie - ze zijn altijd op dezelfde golflengte als de spannende licht. Eraan te herinneren dat in de lucht, licht 30 cm reist in 1 nanoseconde helpt bij het lokaliseren van de oorsprong van reflecties.
Filter of glas fluorescentie kan ook leiden tot een artefact, met name bij lage monster fluorescentie, maar dit kan gemakkelijk worden geïdentificeerd door het nemen van een meting zonder het monster: als er een verval is verkregen onder deze omstandigheden is te wijten aan het instrument en heeft niets te maken met het monster! Aan de andere kant op dat monster autofluorescentie ook kan bijdragen aan een fluorescentievervaltijd.
Na verloop van tijd-gecorreleerde single photon tellen (TCSPC), time-to-amplitude converter (TAC) niet-lineariteiten kan resulteren in slechte aanvallen, maar kan worden geïdentificeerd door het blokkeren van de excitatie en glanzend omgevingslicht, bijvoorbeeld van het doorgelaten licht bron op het monster en het meten van de timing. Een constante achtergrond dientbij elke pixel van het beeld. Regio's waar de afwijkingen van een constante achtergrond gebeuren, zal nooit leveren een goede pasvorm en dient vermeden te worden voor de meting als ze niet kunnen worden verholpen door het aanpassen van de parameters voor de TCSPC kaart.
Een beruchte artefact in TCSPC is foton pile-up die wordt veroorzaakt door een te hoge foton detectiegraad. 11,12 Dit leidt tot alleen de eerste foton wordt getimed, het negeren van eventuele latere fotonen, omdat de elektronica bezig zijn timing en de verwerking van de eerste foton. Stapel-up leidt tot een verkorting van de fluorescentie levensduur en de beste manier om dit te voorkomen is om het foton telsnelheid te houden op ongeveer 1% van de laser herhalingsfrequentie.
Kijk
Er zijn verschillende uitvoeringen van FLIM, en afhankelijk van de toepassing, elk zijn voor-en nadelen. 13 ideale fluorescentiemicroscoop verkrijgen zou het hele multidimensionale fluorescentie emission contour van de intensiteit, positie, levensduur, golflengte en polarisatie in een enkele meting, met een enkele foton gevoeligheid, een maximale ruimtelijke resolutie en minimale acquisitie tijd. Er is momenteel geen technologie met deze unieke combinatie van functies, en op te bouwen blijft een uitdaging voor instrumentatie ontwikkelaars. De toepassing van nieuwe fysische technieken om belangrijke problemen in de celbiologie is vaak het pad naar onverwachte ontdekkingen, en er is een lange weg te gaan voordat we dicht bij het verzadigen van de mogelijkheden van fluorescentie beeldvorming voor de celbiologie. Inderdaad, imaging parameters zoals fluorescentie levensduur spectrum en polarisatie, en beeldvorming sneller in 3D hogere ruimtelijke resolutie bepaalde nieuwe aspecten celbiologie onthullen.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
MKK bedankt de Britse Engineering and Physical Science Research Council (EPSRC) Life Sciences-interface programma voor een persoonlijke Fellowship. We willen ook graag voor de financiering bevestigen door Biotechnologie in het Verenigd Koninkrijk en Biologische Wetenschappen Research Council (BBSRC).
Materialen
Voorbeeld met fluorescerende moleculaire rotoren
Hardware:
omgekeerde Leica TCS SP2 confocale scanning microscoop
Coherente Mira 900 Ti: Sapphire femtoseconde laser met een Verdi V6 pomp laser-of Hamamatsu PLP-10 470 picoseconde gepulste diodelaser excitatie bronnen
Becker & Hickl SPC 830 bord in 3 GHz, Pentium IV, 1 GB RAM computer met Windows XP
gekoelde Becker & Hickl PMC100-01 detector hoofd op basis van Hamamatsu H5773P-01 fotomultiplicatoren, gemonteerd op X1 microscoop-poort, of hybride detectoren
DCC 100 detector regelmodule
Software:
TRI-2 14 of SPCImage 2.8 van Becker & Hickl
Referenties
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area. International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).
- Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269, 847-850 (1995).
- Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).
- Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A. Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. Demchenko, A. P. 8, Springer. Berlin Heidelberg. 267-308 (2010).
- Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors. J. Biol. Eng. 4, (2010).
- Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).
- Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).
- Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes. J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).
- Förster, T., Hoffmann, G. Die Viskositätsabhängigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme. Zeitschrift für Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).
- vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy. J. Fluores. 15, 377-413 (2005).
- Becker, W. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , Springer. (2005).
- O'Connor, D. V., Phillips, D. Time-correlated single-photon counting. , Academic Press. New York. (1984).
- Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).
- Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).
Herprints en machtigingen
