Summary
Neuronale Vorläuferzellen der Transplantation ist eine vielversprechende Strategie für den Schutz und / oder Wiederbeschaffung verlorener / dysfunktional Gebärmutterhals phrenicus Motoneuronen im Rückenmark Verletzungen (SCI) und der Motor Neuron Erkrankung, amyotrophe seitlichen Sklerose (ALS). Wir bieten ein Protokoll für die Zelle Lieferung an zervikalen Rückenmarks Vorderhorn in Nagermodellen von ALS und Rückenmarksverletzungen.
Abstract
Respiratory Kompromiss aufgrund phrenicus Motoneuronen Verlust ist eine schwächende Folge ein großer Teil der Menschen traumatische Rückenmarksverletzungen (SCI) Fälle 1 und ist der ultimative Todesursache bei Patienten mit motorischen Neurons Erkrankung, amyotrophe seitlichen Sklerose (ALS) 2.
ALS ist eine verheerende neurologische Erkrankung, die durch relativ schnelle Degeneration der oberen und unteren Motoneuronen gekennzeichnet ist. Patienten letztlich erliegen der Krankheit im Durchschnitt 2-5 Jahre nach der Diagnose aufgrund der Atemlähmung durch den Verlust von phrenicus Motoneuronen innnervation der Membran 3. Die überwiegende Mehrheit der Fälle sind sporadisch, während 10% der familiären Form sind. Etwa zwanzig Prozent der familiären Fälle sind auf verschiedene Punktmutationen in der Cu / Zn-Superoxiddismutase 1 (SOD1)-Gen auf Chromosom 21 4 verbunden. Transgene Mäuse und Ratten 4,5 6 Mitführen mutierten SOD1 menschlichen Gene (G93A, G37R, G86R, G85R) generiert wurden, und trotz der Existenz der anderen Tiermodellen der Motoneuronen Verlust, sind derzeit die am meisten verwendeten Modelle der Krankheit .
Rückenmarksverletzung (SCI) ist eine heterogene Gruppe von Bedingungen, die aus physischen Trauma des Rückenmarks, mit dem funktionellen Ergebnis je nach der Art, Lage und Schwere der Verletzung 7. Dennoch beeinflussen etwa die Hälfte der menschlichen SCI Fällen Gebärmutterhalskrebs Regionen, die sich in lähmenden respiratorischen Dysfunktion aufgrund phrenicus Motoneuronen Verlust und Verletzung absteigend bulbospinal Atemwege Axone 1. Eine Reihe von Tiermodellen für SCI entwickelt worden, mit dem am häufigsten verwendeten und klinisch relevanter als die Prellung 8.
Die Transplantation von verschiedenen Klassen von neuronalen Vorläuferzellen (NPCs) ist eine vielversprechende therapeutische Strategie für die Behandlung von traumatischen ZNS-Verletzungen und Neurodegeneration, einschließlich ALS und Rückenmarksverletzungen, wegen der Fähigkeit, verloren gegangene oder dysfunktionalen CNS Zelltypen, bieten Neuroprotektion zu ersetzen, und liefern Gen Faktoren von Interesse 9.
Tiermodelle von ALS und SCI modellieren können viele klinisch-relevanten Aspekte dieser Krankheiten, einschließlich phrenicus Motoneuronen Verlust und damit der Atemwege Kompromiss 10,11. Um die Wirksamkeit von NPC-Strategien auf die Atemfunktion in diesen Tiermodellen der ALS und Rückenmarksverletzungen zu bewerten, müssen zelluläre Eingriffe speziell in Regionen mit therapeutisch relevanten Ziele wie phrenicus Motoneuronen gerichtet werden. Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll für Multi-Segment, intraspinale Transplantation von NPCs in den zervikalen Rückenmarks ventralen grauen Substanz von neurodegenerativen Modellen wie SOD1 G93A Mäusen und Ratten, sowie Rückenmark verletzt Ratten und Mäusen 11.
Protocol
Methoden
1. Cell Preparation
Als Beispiel werden wir das Verfahren zur Herstellung Gliazellen Vorläuferzellen 12 für die Transplantation aufgrund unserer Erfahrungen mit diesem Zelltyp zu beschreiben. Allerdings werden die Besonderheiten des Protokolls, einschließlich Mittel-und Verwendung von Trypsin zum Beispiel auf den jeweiligen Zelltyp werden für die Transplantation verwendet abhängen.
- Pre-warm alle Lösungen auf 37,0 ° C im Wasserbad.
- Spülen Kolben 2X mit HBSS. Add 5,0 mL/T-75 Kolben von 0,05% Trypsin / EDTA. Inkubieren Flasche für 3 Minuten in 37,0 ° C Inkubator. Man reibt 3X sanft in Kolben mit 5 oder 10 ml Pipette.
Optional: Fügen Sie 5,0 mL/T-75 Kolben von 1,0 mg / ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor in DMEM/F12.
- Spülen Sie jede Flasche 2X in 5,0 ml Medium. Pool-Zellen und spült. Keep Zellen auf Eis für alle weiteren Schritte.
- Spin bei 200-300 g für 5 Minuten in konischen Rohr: vorzugsweise in Zentrifuge abgekühlt auf 4 ° C. Dekantieren (und speichern) Überstand. Re-suspend-Zellen in 1,0 ml Medium und Transfer zum 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen.
- Zählen von Zellen mit Zählkammer mit Trypanblau zur Rentabilität zu bestimmen.
- Spin wieder in 1,5 ml Tube (800 RPM für 10 Minuten: vorzugsweise in Zentrifuge abgekühlt auf 4 ° C). Dekantieren (und speichern) Überstand.
- Re-suspend-Zellen in der gewünschten Endvolumen von mittel-bis geeignete Zelldichte zu erreichen.
- Verteilen Zellsuspensionen auf mehrere 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen. Keep Zellen auf nassem Eis bis zur Transplantation.
Verwenden Sie keine 0,75 ml Röhrchen, wie die Hamilton-Spritze / Nadel nicht tief passen in dieses Rohr. Multiple Injektionen wird wahrscheinlich während der Operation Sitzungen getroffen werden, und man will verhindern, daß das gleiche Rohr von Zellen viele Male. Versuchen Sie, mindestens 50% mehr Volumen der Zellsuspension als benötigt wird, vorzubereiten. Keep Zellen auf Eis während der Operation Sitzung. Transplant-Zellen innerhalb von 4-5 Stunden der Vorbereitung von Zellsuspensionen, um größte Lebensfähigkeit der Zellen nach der Transplantation zu gewährleisten.
2. Vorbereitung vor der Operation
- Conduct relevanten Baseline-Verhalten Einschätzungen vor der Operation.
- Immunsuppression: subkutane Cyclosporin A (CSA: 10,0 mg / kg Körpergewicht) oder intraperitoneal (IP) FK-506/Rapamycin (1,0 mg / kg Körpergewicht) sollte gestartet mindestens 3 Tage vor der Transplantation werden, und sollte täglich bis zu opfern gegeben. Verwaltung im Trinkwasser (statt der täglichen Injektionen) wird nicht empfohlen. CSA ist unser Immunsuppressivum der Wahl, wenn die Transplantation Nagetier-abgeleiteten Zellen, während FK-506/Rapamycin ist unsere Wahl, wenn die Transplantation Menschen stammenden Zellen.
- Autoclave chirurgische Instrumente vor der Operation. Bereiten Sie einen sauberen und sauberen Ort der Operation zu tun, sowie eine übersichtliche Ort, um Werkzeuge gelegt. Ein Glas-Bead-Sterilisator ist ebenfalls nützlich. Bewahren Sie alle Werkzeuge sauber (insbesondere Rongeur) während der Operation, da dies macht das Verfahren sehr viel einfacher. Jegliches Material während des chirurgischen Eingriffs verwendet wird, muss steril sein.
- Geräte, die nicht wie das Operationsmikroskop sterilisiert werden können, sollten Sie mit einem geeigneten Desinfektionsmittel abgewischt werden und die Griffe mit sterilem Material (zB Gaze) abgedeckt, so dass der Chirurg, einmal zog mit sterilen Handschuhen, nicht verunreinigt sein / ihr Handschuhe.
- Der Operateur sollte seine / ihre Hände mit einem Desinfektionsmittel (Chlorhexidin scrub) waschen, bevor Anfang der Operation. Der Chirurg wird trage sterile Handschuhe, Gesichtsmaske und ein sauberes Gewand.
3. Chirurgie: Animal Vorbereitung und Chirurgie
Tierische Prep:
- Wiegen Tier und verwalten geeignete Dosis der Narkose: Isofluoran Inhalation oder Betäubungsmittel-Cocktail (geliefert via IP) von [Acepromazin Maleat (0,7 mg / kg), Ketamin (95 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg)].
- Pinch Zehen-und / oder die Verwendung der Augenlidreflexe (Berühren des oberen Augenlids mit Wattestäbchen zu beobachten blinkt), um festzustellen, ob Tier richtig betäubt. Die Hornhaut sollte auf Grundlage eines künstliche Tränenflüssigkeit Salbe vor der Operation geschützt werden.
- Shave wieder Haare mit elektrischen Rasierer (keine Befestigung nötig). Shave von etwas rostral Ohren bis in die Mitte des Tieres zurück. Shave gut, und entfernen Sie schneiden Haare aus der Haut, Haare bekommen in Einschnitt zu verhindern. Die chirurgische prep sollte weg von dem Bereich, wo die Operation durchgeführt, um eine Kontamination des Operationsfeldes mit streunenden Haare zu vermeiden sein wird durchgeführt werden.
- Soak Gaze mit Povidin-Jod antiseptischen Lösung und gelten für Haut über rasierten Bereich. Die Operationsstelle, sind auszuwaschen, mindestens zweimal mit der Povidin-Jod-Lösung, wobei darauf geachtet, aus der Mitte der Seite gegen die Peripherie zu schrubben. Die Seite kann dann mit 70% Alkohol oder verdünnter keimtötende schrubben gespült werden. Der Bereich sollte mit sterilen Tüchern abgedeckt werden.
- Während der Operation, Pad die Verwendung eines Heiz-is dringend empfohlen, das Tier normale Körpertemperatur aufrecht zu erhalten. Darüber hinaus sollte die Körpertemperatur überwacht werden. Legen Tier rollte Gaze. Für einen erwachsenen Ratte, sollte der gewalzten Gaze ~ 1,0 Zoll in der Dicke und ~ 6,0 cm in der Länge sein. Band dieses Pad eine Operation Bord, so dass es sich nicht bewegen. Legen Tier-Pad auf der Ebene der Brust / Schulter. Strecken Sie beide Arme auf Kissen und Tape-Waffen niederzulegen, um Chirurgie Bord. Die Idee ist, den zervikalen Rückenmarks so einrichten, dass es einfacher, in der Chirurgie arbeiten, da das Halsmark tief unter der Oberfläche der Haut gefunden wird prop.
Chirurgie:
- Auf der untersten Mikroskopvergrößerung (wir verwenden 8-fache Vergrößerung), verwenden Skalpell zu Mittellinienschnitt machen. Stretch Haut seitlich mit der anderen Hand, um Haut straff (was macht die Haut leichter incise), und machen Schnitt von der Schädelbasis zum Schulterblatt. (Siehe Abbildung 1)
- Verwenden Skalpell zu Einschnitt bis 3 Muskelschichten zu machen über die Wirbelsäule. Leicht drücken Sie die Muskeln (von lateral nach medial) auf beiden Seiten mit der anderen Hand. Achten Sie darauf, fest genug drücken mit dem Skalpell, um alle Muskelschichten mit der geringsten Anzahl der Schnitte wie möglich zu schneiden, so dass Muskeln Einschnitte nicht werden gezackt, die am Ende der Operation einfacher Naht macht. Jedoch nicht zu fest drücken, um zu verhindern schaffen Schäden in tieferen Gewebeschichten (Wirbelsäule).
- Mit zwei Wattestäbchen verwenden Drehbewegung darüberliegenden Muskel von paravertebralen Muskulatur zu trennen. Man kann hier kräftig. Nicht schneiden oder reißen, da diese Blutungen verursachen. Drehbewegung mit den Applikatoren wird schön ärgern das Gewebe auseinander, ohne dass Schäden oder Blutungen. Wenn Blutung in jeder Phase der Operation ist es am besten, geduldig zu sein. Versuchen Sie nicht vorpreschen mit vielen Blutungen, weil das Blut Vision des OP-Feldes obskuren wird. Kauterisation oder leichten Druck kann auf der Website von Blutungen angewendet werden, aber wir finden, dass Geduld ist am besten. Mit etwas Übung sollte es keine oder nur geringe Blutungen während dieser Operation.
- Retract Muskel mit 4 hausgemachte Retraktoren (siehe Abbildung 2). Diese Haken können aus stabilem Büroklammern in ein Retraktor (siehe Abbildung 2-Kasten) geformt werden. Autoclave diese vor der Operation. Es ist darauf zu den Enden der Haken stumpf zu Gewebeschäden zu vermeiden. Tie String Retraktor. Exposure sollte Quadrat / Rechteck-Form. Diese Form kann durch Ziehen an 4 Ecken mit den 4 Haken erreicht werden. Tape-String an Bord, um Retraktoren sichern (siehe Abbildung 2). Kommerziell erhältliche Retraktoren kann auch dazu verwendet werden, aber wir lieber nicht, diese zu nutzen. Es ist entscheidend, um eine gute OP-Feld zu schaffen, um klar in der Chirurgie zu sehen. Nicht "blind" entlang weiter.
- Klare paraspinalen Muskel von Dorsalfläche Wirbelsäule. Um mit paravertebralen Muskeln auf der dorsalen Fläche der Wirbelsäule, gibt es 2 mögliche Strategien. Für die erste Strategie, verwenden rat-Hakenpinzette und mittlere Frühling Schere paraspinalen Muskel von dorsalen Oberfläche der Wirbel zu entfernen. Versuchen Sie, schneidet sehr nah an Knochen besser zu entlarven Knochenoberfläche zu machen. Machen Schnitte parallel zur Oberfläche der Wirbel, aber nicht abgeholzt in Kordel. Für den zweiten Ansatz, einen Medianschnitt in para-Wirbelsäulen-Muskulatur und Einfahren seitlich mit kleineren Haken. Im zweiten Ansatz kann der Muskel dann wieder zusammen nach einer Operation genäht werden.
- Reinigen Sie die Oberfläche von Wirbelknochen gut. Verwenden Sie Rongeur (die wichtigsten chirurgischen Instrument), um wegzuziehen Muskel von Ebenen C4, C5 und C6 (siehe Abbildung 3). Dies ist natürlich abhängig von der Wirbelsäule Ebenen, ausgerichtet sind. Bei der Verwendung von Rongeur mit einer Hand zu sichern gesamten Wirbelsäule durch Greifen Muskel über C2-Prozess mit rat-Hakenpinzette in anderen Hand. C2 ist die große rostral Prozess in das OP-Feld. C3 ist etwas unter den Muskel als auch. C4, C5 und C6 sind leicht zugänglich, weil sie wenig Muskeln darüberliegenden haben.
- Beginnen Sie mit Laminektomie des C5. Wieder zu sichern, indem C2 mit Ratten-Hakenpinzette. Schnappen gesamte Lamina (siehe Diagramm: grab in der Nähe der Mittellinie) mit Rongeur. Position Rongeur so, dass Tool ist komplett senkrecht zur Achse der Wirbelsäule. Langsam crush Lamina. Drücken Sie nicht nach unten in das Rückenmark, da dies zu Schäden an der Wirbelsäule Gewebe verursachen. Crush und ziehen gebrochen Stück des Knochens nach oben. Rongeur sollte crush Stück, so dass man leicht wegziehen können zu entfernen. Wenn Stück Knochen noch mit dem Rest der Lamina angebracht, nicht zerren, wie diese Blutungen und möglicherweise eine Schädigung des Rückenmarks führen wird. Rongeur sollte sauber und scharf. Instrumente wie der Rongeur sollten gewaschen / abgewischt werden mit steriler Kochsalzlösung, die in einem sterilen Behälter bereitgestellt werden können (siehe Abbildung 4).
Für die erstmalige Öffnung der Laminektomie, die Positionierung der Rongeur senkrechtrecht zur Wirbelsäule ist vorzuziehen. Dieser Schritt kann dann, indem man kleine "Häppchen", um die Laminektomie, indem Sie die Rongeur sanft unter den Knochen mit einer ca. 30-60 Grad-Winkel in Bezug auf die Schnur Oberfläche erstrecken befolgt werden. - Extend Laminektomie alle C4-C6 Lamellen. Machen Sie eine durchgehende Öffnung in den Knochen über drei Ebenen der Wirbelsäule. Das Ausmaß der Laminektomie kann auf der Grundlage der gewünschten Stelle (n) der intraspinalen Injektion eingestellt werden.
- Verlängern Sie Laminektomie zu weit seitlich, da diese Blutungen verursachen. Um Vorderhorn Ziel ist die Injektionsstelle relativ medial, so ist es unnötig, Laminektomie weit seitlich zu erweitern. (Siehe Abbildung 5)
- Vergrößerung erhöhen, um ~ 15 x.
- Reinigen Sie Bindegewebe (und mögliche getrocknetes Blut) auf der Oberseite der Dura mit scharfen / gerade # 5 Pinzette. Der Unterschied zwischen Bindegewebe und dura muss mit der Erfahrung gelernt werden.
- Incise dura, ein sehr hartes meningealen Schicht, entweder mit Mini-Feder-Schere oder microknife. Machen Schnitt parallel zur Achse der Wirbelsäule knapp medial der Eingangszone der dorsalen Wurzelfasern. Dies wird erlauben, die Vorderhorn Ziel. (Siehe Abbildung 6)
- Scharfe / gerade # 5 Pinzette zu greifen und leicht anheben dura off des Rückenmarks. Nicht quetschen / verletzen Rückenmark. Dies erfordert einige Übung. Machen Einschnitte mit microknife oder sehr kleine Feder Schere. Verletze nicht Rückenmark.
- Extend Schnitt leicht rostral-kaudale Achse. Tension der Dura in den Kurven leicht dura, um einen schönen Exposition des Rückenmarks zu schaffen.
- Machen Einschnitte auf allen geeigneten Standorten für jede vorgesehene Injektion. Dura hat eine trübe transluzente Aussehen, während das Rückenmark Oberfläche hat eine hellere weiß-farbiges Aussehen. Man wird lernen müssen, um diese auseinander zu unterscheiden. Es ist ratsam, nicht zu versuchen, durch die Dura mit der Injektionsnadel zu injizieren. Die Dura ist hart, so dass es schwer sein wird zu durchdringen sie. Darüber hinaus können Piercing durch die Dura beeinflussen die Flugbahn des Nadel Einsetzen und betreffen daher die anatomisch gezielte Abgabe von Zellen.
- Inject Zellen bilateral auf 3 Ebenen (6 Seiten insgesamt) bis zu großen Region Cervicalanschwellung Ziel. Die Anzahl und Standort (e) von Injektionen, hängt natürlich von der jeweiligen Experiment.
- Nach dem Durchstechen dura, wird Liquor ausgießen. Trockene Oberfläche der Schnur und die gesamte Exposition mit Gaze oder Wattestäbchen.
- Für Zellinjektion, verwenden 10.0μL Hamilton gasdicht RN Spritze.
- Bringen Sie 33-gauge / 45-Grad abgeschrägt Metall RN Hamilton Nadel. Die Nadel sollte scharf sein. Verwenden Sie die gleiche Nadel für nur ~ 20 Injektionen (die Nadel wird schärfer mit weniger Injektionen). Man kann auch gezogen Glaskapillaren für Nadeln. Verwenden Sie Epoxy gezogen Glas Spitze bis 26-Gauge-Nadel stumpf Hamilton Metall befestigen. Trim äußeren Spitze Durchmesser bis ~ 75,0-100,0 ul (abhängig vom Durchmesser der Zellen: will man nicht die Zellen während des Prozesses der Injektion Schaden) mit einem Operationsmikroskop und Mikrometerbereich gleiten. Wir bevorzugen die 33-Feinstblechverpackungen Nadeln.
- Zellen aus der Suspension leicht in die Eppendorf-Röhrchen auf Eis. Unmittelbar vor dem Laden der Injektionsspritze, klopfen Sie leicht Rohr, bis die Zellen wieder in Suspension gehen. Nicht Flick zu intensiv, da dies Zellen und / oder Blasen verursachen verletzen. Alternativ können Sie 20.0μL Pipette-Mann vorsichtig mischen Zellen: Pipette Zellsuspension nur ein oder zwei Mal rauf und runter.
- Legen Sie genügend Zellsuspension Volumen für nur eine Einstichstelle. Zellen aus der Suspension in Injektionsspritze, wenn man plant mehrere Injektionen zu tun. Langsam nehmen Zellen in die Spritze auf Luftblasen und / oder Schäden an Zellen zu vermeiden. Speziell für die Glia-Vorläuferzellen mit denen wir arbeiten in unserem Labor, injizieren wir 2,0 ul der Zellsuspension in einer Verdünnung von 50,000-75,000 Zellen pro 1,0 ul über 2-5 Minuten. Wir haben festgestellt, dass 2uL/site nicht in Gewebeschäden im zervikalen Rückenmarks führen. Stattdessen schlägt unsere Erfahrung, dass eine starke Erhöhung der Anzahl von Zellen in diesem Band (vor allem wenn sie in der Größe größer als unsere Vorfahren Gliazellen sind: 10,0 -20,0 um im Durchmesser) kann zu Schäden an Rückenmark Parenchym verursachen. Wir haben ein umfangreiches Zelle Dosierung experimentieren, um die optimale Anzahl von Zellen zu bestimmen, um an jeder Stelle gespritzt wird (zumindest in der intakten zervikalen Rückenmarks). Die Parameter müssen für den jeweiligen Zelltyp und Krankheitszustand ermittelt werden.
- Line up Spritze / Nadel parallel zur Achse der Wirbelsäule richtig Ziel gewünschten anatomischen Region. Die Nadel ist gerade genug (ca. 80-Grad gegenüber der OP-Tisch) abgewinkelt, um nicht bump den chirurgischen Bereich Kopf, aber so nah an 90-Grad wie möglich. Untere Spitze in Richtung des Rückenmarks Dorsalfläche mit Mikroskop (siehe Abbildung 7).
- Ziel Nadel knapp medial Eintrag zone der dorsalen Wurzelfasern (siehe Abbildung 8). Sanft-Touch-Oberfläche des Rückenmarks mit der Nadelspitze. Leicht eindrücken Rückenmarks mit Nadel. Retract Nadel bis Rückenmark ist wieder normal. Notieren Sie diese Position als z = 0,0 mit dem Lineal auf den Mikromanipulator.
Hinweis: Wir routinemäßig nicht zur Stabilisierung der Wirbelsäule während des zervikalen Rückenmarks Injektionen. Mit unserem Anästhesie-Regime hat up-and-down Bewegung des zervikalen Rückenmarks durch schweres Atmen nie ein Thema gewesen. Allerdings, wenn schweres Atmen Sie ein Problem ist, kann die Wirbelsäule stabilisiert mit einem angepassten Rahmen durch leichtes Spannen der Knochen und die umliegenden para-Wirbelsäulen-Muskulatur auf einem Niveau C2 und C7 mit modifizierten Zange geholt werden, darauf achten, daß die Wirbelknochen zerdrücken oder verletzen zugrunde liegende Rückenmark. Wenn das Tier die Atmung wird flach während des Verfahrens, sollte mehr Anästhetikum zur Verfügung gestellt werden. Die Operation sollte unterbrochen werden, bis eine chirurgische Ebene der Narkose wurde vor der Wiederaufnahme erneut erreicht werden. - Etwas geringere Nadel in das Rückenmark. Achten Sie darauf, in Mikroskop schauen, während dies zu tun. Lower Nadel zu einer Tiefe von 1,5 mm bis Vorderhorn bei erwachsenen Ratten Ziel. Lower Nadel zu einer Tiefe von 0,75 mm bis Vorderhorn in erwachsenen Mäusen Ziel. (Siehe Abbildung 9). Diese Tiefe Zahlen sind repräsentativ für Erwachsene (mindestens 3 Monate alt) weibliche und männliche Sprague-Dawley-Ratten (250-450 Gramm) und C57BL / 6 Mäuse (20-35 Gramm). Natürlich, Tiefe und seitlichen Position auf der spezifischen Region von Interesse ab. Bitte nicht stören Einspritzanlage / Chirurgie Bord oder OP-Tisch, während Nadel in das Rückenmark eingeführt wird, um Schäden an der Wirbelsäule Gewebe zu vermeiden.
- Warten Sie zwei Minuten (länger ist noch besser) nach dem Absenken Nadel auf die gewünschte Tiefe vor der Injektion.
- Inject 2,0 ul über 2-5 Minuten bei konstanter Geschwindigkeit mit Hilfe der Pumpe-Controller.
- Warten Sie zwei Minuten (mehr ist besser) nach der Injektion, bevor sich langsam entfernen Nadel aus Rückenmark.
- Saubere Spritze mit dH2O nach jeder Injektion, um ein Verstopfen zu verhindern. Langsam erstellen und zu vertreiben 3-5 mal. Ziehen Sie keine Luft in die Spritze.
- Zurück zur niedrigsten Vergrößerung (wie zu Beginn der Operation eingesetzt: ~ 8 x). Suture dura geschlossen mit 9-0 Nahtmaterial, aber das ist definitiv nicht notwendig. Es ist auch eine Herausforderung. Wir vernäht dura geschlossen in der Vergangenheit, aber wir finden keinen Unterschied im Verhalten der Tiere, Transplantation das Überleben oder Rückenmark Histologie, wenn die Dura nicht mit einer Naht geschlossen. Die Dura kann mit einer Schutzschicht Stück sterile Gel-Schaum abgedeckt werden. Das Gel-Schaum sollte direkt auf der Dura Inzisionsstelle platziert werden. Allerdings ist es wichtig, dafür Sorge in nicht abrupt ziehen dieses Stück Gelschaum von der Oberfläche des Rückenmarks während der Post-Perfusions Dissektion, wie die Gelschaum kann manchmal eng an das Rückenmark Oberfläche haften zu nehmen.
- Optional: Suture paraspinalen Muskel geschlossen mit 4-0 Nahtmaterial.
- Naht verschlossen drei darüber liegenden Muskelschichten auf einmal mit 4-0 Nahtmaterial. Suture Muskeln an drei Standorten in der rostral-kaudale Achse (siehe Abbildung 10).
- Staple Haut geschlossen mit 9,0 mm gewickelt Clips (siehe Abbildung 11). Ziehen Sie Heftklammern mit Nadelhalter zu Tier Abziehen Klammern vor der vollständigen Wundheilung verhindern. Raum Heftklammern etwa 0,5 cm voneinander entfernt. Nicht zu fest anziehen Wundklammern, da dies zu einer Beeinträchtigung der Heilung und Nekrose führen kann.
- Bewerben Povidin-Jod antiseptischen Lösung mit getränkten Gaze gewickelt.
- Lassen Tier auf zirkulierende Warmwasser-Pad zu erholen. Gib sub-kutane Injektion von sterilem Ringer-Laktat-Lösung (5,0 ml für Ratten, 0,5 mL für Maus) unmittelbar nach der Operation. Follow-up-Injektionen kann auch vorgesehen, wenn das Tier erscheint dehydriert und / oder lustlos sein. Eine prophylaktische Antibiotika-Behandlung mit 6.0mg/kg von Cefazolin kann verwendet werden, schlägt jedoch vor, unsere Erfahrung, dass diese Transplantation nicht in post-operativen Infektionen führen, wenn aseptischen Bedingungen befolgt wird und alle Instrumente / chirurgisches Material sterilisiert werden. Wenn diese Vorsichtsmaßnahmen eingehalten werden, ist eine Antibiotika-Gabe abgeraten.
- Weiter CSA oder FK-506/Rapamycin täglich bis zu opfern.
- Die gesamte Operation dauert weniger als ~ 45 Minuten (mit 6 Injektionsstellen). Ansonsten wird das Tier beginnen aufzuwachen und atmen stärker, was sich negativ auf die Injektion in das Rückenmark.
Tipps zur Fehlerbehebung bei Problemen mit einzelnen Schritte des Protokolls Assoziierte
Fehlende / schlechte Überleben der Zelle: Das ist wahrscheinlich nicht ein technisches Problem mit der Injektion verbunden, aber ist wahrscheinlich auf Eigenschaften der Zelle Typ der Injektion und / oder die Immunsuppression Regime. Diese Probleme müssen empirisch auf einer Zell-Typ und Tiermodell spezifischen Einzelfall geprüft werden. Die Verfügbarkeit einer Reihe von immundefizienten Ratten-und Mausmodellenstehen ebenfalls zur Verfügung, um Probleme mit Immunsuppression zu umgehen, aber diese Tiere auch Schwierigkeiten wie Kosten, die Notwendigkeit der Beibehaltung einer Kolonie, und zusätzliche Vorsicht geboten während der Operation und Gehäuse.
Funktionale Defizite beobachtet nach der Operation: Nach unserer Erfahrung haben wir nicht das Auftreten von funktionellen Defiziten nach diesem Verfahren, wenn sie durch Maßnahmen wie Vorderbein und Hinterbein Greifkraft und phrenicus / Membran-Verbindungen Muskel Aktionspotentiale beurteilt beobachtet, sogar mit 6 Injektionen Standorte ( von 2μL jeder) in der zervikalen Rückenmarks. Gewebezerstörung, wurde ebenfalls nicht beobachtet. Mögliche Gründe für das Auftreten dieser Probleme sind: nicht mit dem vorgeschlagenen Nadelabstand, Injektion größerer Volumina und / oder Zellzahlen, unbeabsichtigte Schäden durch unsachgemäße Laminektomie verursacht, Mangel an Delikatesse während des Schneidens die Dura (z. B. Einklemmen des Kabels mit der Nr. 5 Pinzette) oder während des Prozesses des Einsetzens der Hamilton Nadel in das Rückenmark (replace ein stumpfes Nadel).
Zellen nicht in ventralen grauen Substanz gefunden: Dies könnte darauf zurückzuführen sein, eine Reihe von Fragen. Wenn die Injektion schießt am Tor vorbei medial oder lateral, stellen Sie sicher richtig Line-Up der Einspritzanlage parallel mit der Achse des Rückenmarks, und führen Sie die Nadel nur medial, um den Eintrag der dorsalen Wurzelfasern. Wenn die Injektion schießt am Tor vorbei dorsal oder ventral, stellen Sie sicher zu Ihrem z-Achse Lesen Null, wenn die Spitze der Nadel ist gerade noch berühren die dorsale Oberfläche des Rückenmarks, verwenden Sie die entsprechenden Hamilton Nadel mit der entsprechenden Fase (eine längere Fase beeinflussen kann Targeting), versichern, dass das Rückenmark nicht komprimiert, wenn die Nadel, kümmern sich in genau Messtiefe mit dem Mikromanipulator, und verwenden Sie Tiere innerhalb des vorgeschlagenen Gewichtsbereich. Passen Sie Ihre Technik entsprechend, wenn Sie konsequent Injektion werden die Zellen in einem Ort (was histologische Auswertung und anschließende Technik Modifikation). Wenn die Injektionen nach dem Zufallsprinzip auf alle Ihre Injektionsstellen verteilt sind, müssen Sie üben, um die Konsistenz zu verbessern. Wenn die Zellen meist an der Dorsalseite des Rückenmarks an der Stichkanal befinden neigen, länger zu warten, bevor und nachdem Zellinjektion, und erweitern die eigentliche Injektion über einen längeren Zeitraum.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Maus-abgeleiteten glialen Vorläuferzellen transplantiert wurden (50.000 Zellen / site) in das Vorderhorn des Rückenmarks Ebene C4 in einer erwachsenen SOD1 G93A Ratte. Maus-derived transplantierten Zellen können vom Host Rattengewebe über den Nachweis werden mit der Maus-spezifischen Antikörper, M2 aus. Dieses Bild zeigt das Überleben von M2 + Transplantation gewonnenen Zellen nach 1 Monat nach der Transplantation (siehe Abbildung 12). Die Zellen der ventralen grauen Substanz lokalisiert, aber der Injektionsstelle nach medial verpasste den seitlichen Vorderhorn (die Lage der meisten phrenicus Motoneuronen: durch die gestrichelte Linie gekennzeichnet). Keine Zystenbildung gesehen wurde, wenn 50.000 Zellen pro Stelle injiziert wurden, und keine Verhaltensstörungen Beeinträchtigung ergab sich aus der Injektion. Allerdings Injektion von viel höheren Zahlen von Zellen (die tatsächliche Anzahl variiert je nach Zelltyp und sollten systematisch ausgewertet werden) führt zu Schäden an der Injektionsstelle und entlang der Stichkanal (siehe Abbildung 13: Immunhistochemie mit den Astrozyten-Marker, GFAP) .
Abbildung 1. Erste Inzision der Haut. Auf der untersten Mikroskopvergrößerung (wir verwenden 8-fache Vergrößerung), verwenden Skalpell zu Mittellinienschnitt machen. Stretch Haut seitlich mit der anderen Hand, um Haut straff (was macht die Haut leichter zu schneiden), und machen Einschnitt (gekennzeichnet durch dicke gestrichelte Linie) von der Basis des Schädels (auf der Ebene der Rückseite der Ohren) das Schulterblatt (bezeichnet durch dünne gestrichelte Linie).
Abbildung 2. Die Exposition von OP-Feld. Die operative Freilegung sollte Quadrat / Rechteck-Form. Diese Form kann durch Ziehen der umgebenden Muskulatur zu 4 Ecken mit den 4 Haken erreicht werden. Tape-String, der Haken an chirurgischen Bord angebracht wird, um Retraktoren sicher und ordnungsgemäß zu halten Feld zu öffnen.
Abbildung 2-Einschub. Retraktoren für die Exposition des OP-Feld. Die Retraktoren werden verwendet, um pull Rückenmuskel, um einen OP-Feld mit beiden gute Sichtbarkeit des Rückenmarks und ausreichend Platz, eine Operation durchzuführen erstellen. Retraktoren können durch Formen robuste Büroklammern in die gewünschte Form und Größe hergestellt werden. Autoclave die Retraktoren vor einer Operation. Tie String Retraktor.
Abbildung3. Wirbel. Nach dem Entfernen der paravertebralen Muskulatur, gründlich reinigen Dorsalfläche Wirbel mit Rongeur. Individuelle Lamina zu sehen, sowie dorsal Wurzelfasern Eingabe von lateralen Wirbelsäule werden.
Abbildung 4. Laminektomie. Starten Laminektomie bei Rückenmark Ebene C5. Sichere Wirbelsäule, indem Muskel darüberliegenden Ebene C2 mit Ratten Hakenpinzette. Schnappen gesamte Lamina (siehe Diagramm: grab in der Nähe der Mittellinie) mit Rongeur. Position Rongeur so, dass Tool ist komplett senkrecht zur Achse der Wirbelsäule. Langsam crush Lamina. Drücken Sie nicht nach unten in das Rückenmark, da dies zu Schäden an der Wirbelsäule Gewebe verursachen. Crush und ziehen gebrochen Stück des Knochens nach oben. Rongeur sollte crush Stück, so dass man leicht wegziehen können zu entfernen. Wenn Stück Knochen noch angebracht ist, der Laminae Ruhe, nicht zerren, wie diese Blutungen und möglicherweise eine Schädigung des Rückenmarks führen wird. Rongeur sollte sauber und scharf.
Abbildung 5. Exposure von Rückenmark folgenden Laminektomie. Extend Laminektomie alle C4-C6 Rückenmark freizulegen. Mach 1 durchgehende Öffnung in den Knochen über 3 Ebenen der Wirbelsäule. Verlängern Sie Laminektomie zu weit seitlich, da diese Blutungen verursachen. Um Vorderhorn Ziel ist die Injektionsstelle relativ medial, so ist es unnötig, Laminektomie, um die komplette laterale Ausdehnung der Wirbelknochen zu verlängern.
Abbildung 6. Hohe Vergrößerung der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks. Der prominente dorsale Blutgefäß zu sehen liefen der Mittellinie des Rückenmarks werden. Dieses Blutgefäß Muster ist in den meisten Fällen beobachtet, jedoch zeigen einige Tiere eine nicht-Mittellinie Flugbahn des Blutgefäßes. Die dorsalen Wurzelfasern können an der lateralen Seite des Rückenmarks Rücken gesehen werden. Bezogen auf die Dura über dem Rückenmark, haben diese Nerven ein trübes Aussehen.
Abbildung 7. Injection-Setup. Line up Spritze / Nadel parallel zur Achse der Wirbelsäule richtig Ziel gewünschten anatomischen Region. Die Nadel ist gerade genug (ca. 80-Grad gegenüber der OP-Tisch) abgewinkelt, um nicht bump den chirurgischen Bereich Kopf, aber so nah an 90-Grad wie möglich (linkes Bild). Lower Injektion Spitze in Richtung des Rückenmarks dorsalen Oberfläche mit dem Mikroskop (rechts). Sanft-Touch-Oberfläche des Rückenmarks mit der Nadelspitze. Leicht eindrücken Kabel mit Nadel. Retract Nadel bis Rückenmark ist wieder normal flachen Zustand. Notieren Sie diese Position als z = 0,0 mit dem Lineal auf den Mikromanipulator.
Abbildung 8. Hohe Vergrößerung des Rückenmarks Injektion Aim Nadel knapp medial der Eingangszone der dorsalen Wurzelfasern (gekennzeichnet durch gestrichelte Linie).
Abbildung 9. Schematische Darstellung des Rückenmarks: wie man anatomische Region of Interest Target Beim Versuch, die Vorderhorn, incise dura parallel zur Achse der Wirbelsäule knapp medial der Eingangszone der dorsalen Wurzelfasern Ziel.. Dies wird erlauben, die Vorderhorn Ziel. Lower Nadel zu einer Tiefe von 1,5 mm bis Vorderhorn bei erwachsenen Ratten Ziel (das Alter und Geschlecht des Tieres macht nicht viel Unterschied von der Tiefe). Lower Nadel zu einer Tiefe von 0,75 mm bis Vorderhorn in erwachsenen Mäusen Ziel. Natürlich, Tiefe und seitlichen Position auf der spezifischen Region von Interesse ab.
Abbildung 10. Schließung von OP-Gebiet. Naht verschlossen drei darüber liegenden Muskelschichten auf einmal mit 4-0 Nahtmaterial. Suture Muskeln an 3 Standorten in rostral-kaudale Achse.
Abbildung 11. Heften der Haut. Staple Haut geschlossen mit 9,0 mm Wundklammern. Ziehen Sie Heftklammern mit Nadelhalter um das Tier vor dem Abziehen Klammern vor der vollständigen Wundheilung verhindern. Raum Heftklammern ca. 0,5 mm auseinander.
Abbildung 12. Die Transplantation von Gliazellen Vorfahren in Hals Vorderhorn. 50.000 Maus-abgeleiteten glialen Vorläuferzellen wurden in das Vorderhorn des Rückenmarks Ebene C4 in einer SOD1 G93A Ratte transplantiert. M2 + Maus-derived transplantierten Zellen überlebten nach 1 Monat nach der Transplantation. Die Zellen der ventralen grauen Substanz lokalisiert, aber der Injektionsstelle nach medial verpasste den seitlichen Vorderhorn (bezeichnetdurch die gestrichelte Linie).
Abbildung 13. Gewebeschäden nach der Transplantation von hohen Anzahl von neuronalen Vorläuferzellen. Injektion von viel höheren Zahlen von Zellen (die tatsächliche Anzahl variiert je nach Zelltyp und sollten systematisch ausgewertet werden) führt zu Schäden an der Injektionsstelle und an der Nadel zu verfolgen.
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Discussion
Für Studien mit SOD1 G93A Mäusen und Ratten, Alter und Geschlecht entsprechen den Tieren innerhalb einer Gruppe und verteilen Tiere innerhalb der gleichen Wurf zu verschiedenen Gruppen. Es ist besser, alle Tiere aus dem gleichen Geschlecht für ALS und SCI-Modellen verwenden, da Krankheitsprozesse zwischen Männchen und Weibchen unterscheiden können, aber es kann auch nützlich sein, um genügend Tiere aus beiden Geschlechtern, um mögliche geschlechtsspezifische Wirkungen zu erkennen sind, wie Dieses Phänomen hat mit SOD1 G93A Ratten 13 und SOD1 G93A Mäusen 14,15 berichtet worden. Betrachten Sie das Alter / Punkt-Krankheit (ALS für Tiere) oder die Zeit nach der Verletzung (für SCI-Modelle) für die Transplantation von Zellen in Tiere. Diese Strategie wird wahrscheinlich je nach den spezifischen Zell-Mechanismen, die angesprochen werden.
Die hier beschriebene Protokoll kann sowohl für Ratte und Maus zervikalen Rückenmark 11, sowie für die Transplantation in anderen Ebenen der Ratte und Maus Rückenmark wie Brust-und Lendenwirbelsäule Ebenen 14 verwendet werden. Um bestimmte anatomische Strukturen (außer Vorderhorn) in diesen verschiedenen Ebenen des Rückenmarks Ziel ist es ratsam, erste Test der medialen / lateralen Position und Tiefe von Injektionen mit einem Farbstoff oder andere Mittel, um die Genauigkeit der Koordinaten zu bewerten.
Outcome Maßnahmen umfassen eine detaillierte Analyse von Zell-Transplantation Schicksal, biochemischen, histologischen und funktionellen Zuständen des Rückenmarks und Verhaltensänderungen, die für die Lage der Transplantation. Die Besonderheiten des Verhaltens Tests, histologische Analyse und andere Ergebnisse analysierten Maßnahmen nach der Transplantation sollte den experimentellen Anforderungen / Modell zugeschnitten werden.
Mit einem chirurgischen Assistentin betäuben, rasieren, "offen" und "Schließen" der Tiere ist sehr hilfreich für die reibungslose Durchkommen der meisten Tiere wie möglich. Darüber hinaus kann ein chirurgischer Assistent hilft dem Chirurgen, bleiben während des gesamten Verfahrens steril.
Die optimale Anzahl und Konzentration der Zellen injiziert werden je nach Größe der Zellen, die Art des Empfängers Tier, und der Krankheitszustand. Zum Beispiel, im Vergleich zu den intakten Rückenmark, eine erhöhte Anzahl von Zellen in eine SCI Ort geliefert werden können, wenn ein Hohlraum hat bereits 16 gebildet. Allerdings müssen die spezifischen Parameter systematisch optimiert werden, bevor Durchführung einer groß angelegten Studie.
Vor der Durchführung einer großen Studie mit einem bestimmten NPC-Typ, bewerten die langfristige Wirksamkeit der Immunsuppression Regime. Darüber hinaus kann das Überleben der Zelle für einen bestimmten Zelltyp abhängig von der Krankheit Modell oder dem Zeitpunkt und Ort der Transplantation zu variieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Ich möchte danken: allen Mitgliedern der Lepore, Maragakis und Rothstein Labors für hilfreiche Diskussionen, die gelähmten Veteranen von Amerika und der Craig H. Neilsen Foundation für finanzielle Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| 0.05% Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor (optional) | Sigma-Aldrich | T-6522 | |
| Acepromazine maleate (0.7 mg/kg) | Fermenta Animal Health | ||
| Ketamine (95 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | ||
| Xylazine (10 mg/kg) | Bayer AG | ||
| #11 Feather surgical blade | Electron Microscopy Sciences | 72044-11 | |
| Cotton-tipped applicators (6 inch) | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Rat-toothed forceps | Fine Science Tools | Rat: 11023-15; Mouse: 11042-08 | |
| Medium-sized spring scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| Mini spring scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | Rat: 16121-14; Mouse: 16221-14 | |
| Microknife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 12502-14 | |
| Suture: 4-0 | Vicryl | S-183 | |
| Staples: 9 mm | Autoclip | 427631 | |
| Stapler: 9 mm (Reflex #203-1000) | World Precision Instruments, Inc. | 5000344 | |
| Warm water pump (T/Pump) | Gaymar Industries | P/N 07999-000 | |
| Cyclosporin A: 250.0 mg/5.0 mL ampules | Novartis AG | NDC 0078-0109-01 | |
| FK-506 | LC Laboratories | F-4900 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| Injector | World Precision Instruments, Inc. | UMP2 | |
| Micro 4 Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMC4 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Kite-R | |
| 10.0 μL Hamilton syringe | Hamilton Co | 80030 | |
| Hamilton needles: 33-gauge, 45° bevel, 1 inch | Hamilton Co | 7803-05 | |
| Glass 20.0 μL microcapillary pipettes (optional) | Kimble Chase | 71900-20 |
References
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