Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes Published: August 9, 2011 doi: 10.3791/3076
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1St Vincent’s Institute, Department of Medicine, The University of Melbourne, 2Department of Microbiology and Immunology, The University of Melbourne

Summary

Listeria monocytogenes es un organismo modelo para estudiar la respuesta inmune y la susceptibilidad genética a las bacterias intracelulares en ratones. Este método permite medir la carga bacteriana y generar una sola célula suspensiones de hígado y el bazo de los ratones para el análisis de FACS para determinar los cambios en las células inmunes, debido a la infección por Listeria.

Abstract

Listeria monocytogenes (Listeria) es un patógeno Gram-positivo intracelular facultativo 1. Los estudios en ratones suelen emplear la inyección intravenosa de Listeria, lo que resulta en una infección sistémica 2. Después de la inyección, Listeria difunde rápidamente en el bazo y el hígado debido a la absorción por CD8α + células dendríticas y las células de Kupffer 3,4. Una vez fagocitadas, diversas proteínas bacterianas permiten Listeria para escapar del fagosoma, sobrevivir en el citosol, e infectar a las células vecinas 5. Durante los tres primeros días de la infección, las diferentes células inmune innata (por ejemplo, los monocitos, neutrófilos, células NK, células dendríticas) intervienen en los mecanismos bactericidas que reducen al mínimo la proliferación de Listeria. Células T CD8 +, posteriormente reclutados y responsable de la liquidación final de Listeria desde el host, por lo general dentro de 10 días de la infección 6.

Eliminación exitosa de Listeria a partir de ratones infectados depende de la aparición apropiada de las respuestas inmunitarias del huésped 6. Hay una amplia gama de sensibilidades entre las cepas de ratones endogámicos 7,8. En general, los ratones con una mayor susceptibilidad a la infección por Listeria son menos capaces de controlar la proliferación de bacterias, lo que demuestra aumento de la carga bacteriana y / o retraso en el aclaramiento en comparación con los ratones resistentes. Los estudios genéticos, incluidos los análisis de ligamiento y cepas knock-out mouse, se han identificado varios genes que la secuencia de variación afecta a las respuestas del huésped a la infección por Listeria 6,8-14. Determinación y comparación de la cinética de la infección entre las diferentes cepas de ratón es tanto un método importante para la identificación de factores genéticos que contribuyen a la respuesta inmune contra la listeria. La comparación de las respuestas del huésped a diferentes cepas de Listeria es también una forma efectiva de identificar los factores de virulencia de bacterias que pueden servir como blancos potenciales para la terapia con antibióticos o el diseño de vacunas.

Se describe aquí un método sencillo para medir la carga bacteriana (unidades formadoras de colonias [UFC] por tejido) y la preparación de una sola célula suspensiones de hígado y el bazo de FACS análisis de la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria. Este método es especialmente útil para la caracterización inicial de la infección por Listeria en las cepas de ratón novela, así como la comparación de la respuesta inmune entre diferentes cepas de ratón infectado con Listeria. Usamos la Listeria monocytogenes EGD cepa 15 que, cuando se cultivaron en agar sangre, presenta una zona de halo alrededor de cada colonia característico debido a la β-hemólisis 1 (Figura 1). La carga bacteriana y la respuesta inmune se puede determinar en cualquier punto de tiempo después de la infección por el homogeneizado cultivo de tejidos en placas de agar sangre y la preparación de suspensiones de células de tejido para análisis FACS utilizando los protocolos descritos a continuación. Queremos hacer notar que las personas que están inmunocomprometidas o las mujeres embarazadas no deben manipular Listeria, y el correspondiente comité de bioseguridad institucional y manejo de los animales instalación debe ser consultado antes de comenzar el trabajo.

Protocol

1. Cultivo y largo plazo de almacenamiento de Listeria monocytogenes (Listeria)

  1. Hacer o comprar pre-hechos caballo de agar sangre (HBA) placas. Placas secas antes de su uso por los pre-incubación a 37 ° C durante la noche o la colocación de descubierto en una cabina de flujo laminar durante 1 hora.
  2. Obtener viable Listeria de uno de los siguientes: un homogeneizado de tejido infectado del ratón, un stock liofilizado, un stock de glicerol congelado, o una colonia de un cultivo de Listeria reciente (es decir, menos de una semana de edad y no sub-cultivadas más de 10 generaciones) . Todos Listeria se debe obtener con un bucle de inoculación estéril y el empleo de técnicas asépticas para todos los métodos descritos en este protocolo.
  3. Racha de Listeria en una placa HBA como se muestra en la Figura 1 mediante un bucle de inoculación estéril: Listeria racha de más de ¼ de la superficie de la placa como la propagación del inóculo primario. Hacer una serie de rayas unidireccional de la propagación primaria. Repita 2-3 veces rayando con un bucle frescos o re-esterilizados antes de cada conjunto de rayas. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche.
  4. Tienda de Listeria placa HBA a 4 ° C por un período máximo de 1 mes o ir al paso de 1,5 a preparar para la cultura Listeria almacenamiento a largo plazo.
  5. Elija una sola colonia de un cultivo de Listeria fresco en una placa HBA con un asa de inoculación esterilizada y se inoculan 10 ml de infusión cerebro-corazón (BHI) caldo (prepare de acuerdo a las instrucciones del fabricante) en un frasco de 30 ml McCartney.
  6. Incubar el cultivo de Listeria en un agitador orbital a 180rpm a 37 ° C durante la noche.
  7. Añadir glicerol estéril al 80% (v / v) a la cultura Listeria líquido en proporción de 1:1 para obtener una concentración final de glicerol del 40% (v / v). Transferencia de 0,5-1 ml alícuotas en crioviales y almacenar reservas Listeria / glicerol a -70 ° C.

Consejos y notas:

  • El crecimiento de Listeria se puede apoyar en diferentes medios no selectivos, tales como una amplia gama de agar sangre (complementado con caballos, ovejas, cuyes o sangre humana), la infusión cerebro corazón (BHI) o agar caldo o caldo de soja tríptico con la levadura extracto (TSB-YE). El crecimiento de contaminantes puede ser minimizado en la cultura mediante la adición de antibióticos a los medios de comunicación para las cepas de Listeria con la resistencia a los antibióticos definido (por ejemplo, L. monocytogenes 10403S), o mediante el uso de los medios de comunicación de Oxford, que selectivamente apoyar el crecimiento de Listeria.
  • Si Listeria se obtiene de una fuente no probados, se recomienda que las pruebas adicionales se realizaron para confirmar la identidad de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes es Gram positivo, no forman esporas, móviles a <30 ° C, anaerobios facultativos, catalasa positivos, y oxidasa negativa). El cultivo obtenido también pueden ser cultivadas en medios selectivos Listeria para asegurarse de que un cultivo puro se obtiene.
  • Secado de las placas HBA asegura que hay una separación óptima de colonias de bacterias en la placa.
  • Al hacer reservas congeladas de glicerol de la Listeria, el uso fresco culturas HBA Listeria que son menos de 1 semana de edad y sub-cultivadas por las generaciones pocos como sea posible (<5 es el mejor).
  • Al derivar nuevas culturas Listeria a partir de un stock de glicerol congelado, el primer paso debe ser en medio sólido (es decir, placas HBA) por Listeria se obtienen de poblaciones de glicerol congelado crecen débilmente cuando se subcultivan directamente en un medio líquido.

2. Preparación y el almacenamiento de las acciones infecciosas de Listeria en los estudios de infección in vivo

  1. Racha de Listeria a partir de un stock de glicerol congelado (Paso 1.7) sobre una placa HBA como se describe en el paso 1.3. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche para al día siguiente.
  2. Elija una colonia de Listeria único de la cultura y la racha de inocular a 10 ml de caldo BHI. Evitar la transferencia de agar en el caldo.
  3. Incubar la Listeria cultura BHI en un agitador orbital a 180 rpm y 37 ° C a mediados de la fase logarítmica (OD600 = ~ 0,4). Esto suele tardar de 3-4 horas.
  4. Tomar una alícuota de 0,9 mL aséptica y obtener una lectura de DO a 600 nm en las 3-4 horas de agitación. Si OD lectura es <0,3, y luego continuar a la cultura en un agitador orbital a 180 rpm y 37 ° C hasta que la lectura de OD es de ~ 0.4.
  5. Añadir 1 ml estéril 80% de glicerol (v / v) a 10 mL Listeria cultura caldo BHI (OD600 ~ 0,4). Mezclar suavemente y transferir a tubos de 1,5 ml de microcentrífuga en alícuotas de 0,5 a 1 ml.
  6. Coloque las alícuotas sobre el hielo durante 10 minutos y almacenar a -70 ° C. Deje una alícuota congelada para determinar la concentración de Listeria en el stock infecciosa, que es típicamente del orden de 10 9 UFC / mL.
  7. Realizar diluciones seriadas 1:10 de la unfrozen acciones Listeria infecciosas en PBS a 10 -8 dilución. 100 L de propagación sin diluir y de cada dilución posterior a un secado previo placas HBA (paso 1.1) por duplicado, con un esparcidor de vidrio. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche.
  8. Cuente el número de colonias en cada placa y determinar la concentración de Listeria de la cultura de valores infecciosas congelados mediante el siguiente cálculo: la concentración (UFC / mL) = número de colonias x factor de dilución / 0,1 ml. Las placas elegido para contar lo ideal sería tener 30 a 300 colonias para garantizar una estimación fiable de la concentración de UFC de bacterias viables.
  9. Pocos días después de la conservación de existencias infecciosa Listeria a -70 ° C, descongelar un tubo. Determinar la concentración de Listeria viable como se describe en los pasos 2.7 y 2.8. Esta concentración debe ser similar a la fijada para el archivo recién preparada infecciosas en el paso 2.8.

Consejos y notas:

  • Acciones infecciosa Listeria se congela a un glicerol menor porcentaje (8%) que para Listeria congelados general a largo plazo de almacenamiento (40%).
  • Frozen acciones infecciosa Listeria son generalmente estables a -70 ° C hasta por 3 meses. Si se utiliza más de 3 meses, se recomienda que una acción infecciosas nuevas prepararse a partir de una cultura de Listeria fresco en una placa HBA.
  • Si la concentración de las acciones descongelado infecciosa Listeria (paso 2.9) es diferente de las acciones recién preparada como se describe en los pasos 2.7 y 2.8 (es decir, disminución de> 20% en el UFC), entonces un nuevo archivo infecciosas congelados deben estar preparados.
  • Aunque el tiempo inicialmente más lenta que la preparación de un inóculo bacteriano fresco para un solo experimento, la preparación de las existencias congeladas infecciosa Listeria permite una determinación exacta de la concentración de UFC antes de la infección y una mayor coherencia entre los experimentos en ratones están infectados del stock congelado misma.

3. Preparación del inóculo de Listeria y la inyección intravenosa de ratones

  1. Determinar la concentración de Listeria que se inyecta por ratón. Para la inyección intravenosa, UFC en 200 l de inóculo por ratón se utiliza.
  2. Descongelar una alícuota de congelados de las acciones infecciosa Listeria (del Paso 2.6). Diluir el stock infecciosas en PBS a la concentración deseada Listeria UFC. El doble del volumen necesario para la inyección de todos los ratones para asegurar que haya suficiente inóculo para la inyección y la determinación de la Listeria UFC antes y después de la inyección (paso 3.3 y 3.7).
  3. Quitar 2x 0,1 mL alícuotas del inóculo Listeria preparado, y preparar una dilución 1:10 en PBS para cada alícuota antes de la inyección de los ratones. Placa de 0,1 ml de cada dilución en placas HBA, e incubar las placas durante la noche a 37 ° C. Cuente el número de colonias y determinar la pre-inyección de la concentración del inóculo de Listeria: concentración (UFC / mL) = (número de colonias x factor de dilución) / mL plateado para que el factor de dilución.
  4. Transferir el ratón para ser inyectado en una jaula limpia. Caliente el ratón mediante la colocación de la jaula de aproximadamente 50 cm bajo una lámpara infrarroja de 250 vatios durante 5 minutos (otros dispositivos adecuados térmica que no se quema el ratón o el aumento de la temperatura de la caja por encima de 40 ° C también se puede utilizar). Coloque el ratón en un dispositivo de retención para las inyecciones de vena de la cola.
  5. Mezclar suavemente la suspensión de Listeria para mantener una suspensión constante cada vez que se carga una jeringa.
  6. Localizar la vena lateral de la cola del ratón, limpie suavemente con un 70% de etanol limpiar e inyectar 200 uL de inóculo de Listeria (a una concentración deseada) con una jeringa con una aguja de calibre 27. En pocas palabras aplicar presión en la herida de entrada con una gasa estéril. Devolver el ratón a su jaula.
  7. Cuando la inyección de todos los ratones se ha completado, repita el paso 3.3 con la cantidad restante de inóculo para determinar la concentración después de la inyección del inóculo de Listeria.
  8. La cantidad de producto Listeria en ratones se presenta como el promedio de UFC determina a partir de la pre-y post-inyección muestras de inóculo Listeria.

Consejos y notas:

  • Por lo general se inyectan 500 - 3.000 UFC (200 l de 2.500 UFC / ml - 15.000 UFC / mL de inóculo) al comparar la carga bacteriana y la respuesta inmune entre una cepa de ratones resistentes (por ejemplo C57BL / 6) y una cepa de ratones susceptibles (por ejemplo, BALB / c ).
  • Si la acción infecciosas se diluyeron en PBS por lo menos 10 5, y luego una fase de lavado generalmente no se requiere retirar el papel residual / glicerol. Si la acción infecciosa no se diluye en PBS por lo menos 10 5, y luego una fase de lavado se debe agregar en el paso de 3,2 a eliminar los medios de comunicación residual / glicerol como sigue: Add 9 ml de PBS para abastecerse descongelado bacterias infecciosas y recogidas por centrifugación a 2100 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células bacterianas sedimentaron en 10 ml de PBS estéril, repetir la centrifugación y se resuspenden las células bacterianas de pellets en el volumen deseado. Determinar el promedio de UFC de la pre-y post-inyección muestras de inóculo Listeria como se describe en el Paso 3.3 y 3.7. Cabe señalar que este paso de lavado puede resultar en una pérdida de las bacterias, y se recomienda que dicha pérdida se determinará de antemano y cuenta en la toma del inóculo de concentración requerida.
  • Descartar de forma segura la jeringa y la aguja después de inyectar un ratón con Listeria.

4. La eliminación de hígado y el bazo de ratones infectados con Listeria para el análisis

  1. Euthanase el ratón infectado en el punto deseado de tiempo después de la infección usando un método aprobado por el Comité de Ética Animal locales, tales como la asfixia de CO 2.
  2. Realizar sangrar cardiaca inmediatamente después de la eutanasia con una jeringa de 1 ml y aguja de calibre 25. Recoger la sangre tanto como sea posible. Quitar la vesícula biliar y cortar la vena cava inferior.
  3. Exponer la vena porta hepática empujando cuidadosamente los intestinos a la derecha, dar la vuelta a los lóbulos del hígado hacia la cabeza y hacia la izquierda para que el hígado está sentado en el diafragma se encuentra. La vena porta hepática se introduce en la parte inferior del hígado a partir de la parte inferior derecha.
  4. Perfundir el hígado mediante la inyección de 10 ml de PBS en la vena porta hepática con una aguja de calibre 26. PBS inyectado a través de la vena porta se cortó la salida de la vena cava inferior. La perfusión del hígado se asegura de que las células recolectadas son el hígado y no la sangre circulante.
  5. Quitar el hígado perfundido de la cavidad del cuerpo del ratón, en lugar de tampón FACS, y almacenar en el hielo. Ir al paso 5.1 para la preparación del hígado para el análisis de FACS.
  6. Extirpar el bazo del ratón, el lugar en tampón FACS, y almacenar en el hielo.
  7. Pesar el bazo entero, cortado por la mitad, y con un peso una de las mitades. Colocar la mitad en tampón FACS y vaya al paso 6.1. Coloque la otra mitad en una bolsa Stomacher en el hielo y vaya al paso 7.1.

Consejos y notas:

  • En los pasos 4.5 y 4.6, el uso de tampón FACS suficientes para sumergir completamente el tejido para minimizar la exposición de cualquier parte del tejido al aire.
  • A ½ pulgadas de largo aguja de calibre 26 que se dobla en un 30 º mejor puede facilitar la inyección de PBS en la vena porta hepática.
  • Cuando se perfunde adecuadamente, el hígado se vuelve de un color rojo oscuro a marrón claro después de inyectar 1.2 ml de PBS.
  • Si el hígado no es necesario para el análisis FACS, la perfusión no es necesario. El hígado puede ser aislado y se recoge directamente en una bolsa Stomacher y procesada como se describe en el paso 7.
  • Para la eutanasia de los ratones, asfixia de CO 2 es el método preferido porque tiene un impacto mínimo en UFC de bacterias y viabilidad de las células inmunes en el bazo y el hígado. Si la extracción de sangre no es necesaria, la dislocación cervical puede ser utilizado como método de eutanasia alternativa. Se recomienda que no los métodos de eutanasia que pueden afectar el peso del órgano o de la viabilidad celular inmune a ser utilizado (por ejemplo, tiobarbitúricos).

5. Preparación de la suspensión de células hepáticas para el análisis de FACS

  1. Generar una sola célula suspensiones mediante la colocación de hígado con tampón FACS (paso 4.5) en un filtro de 70 micras de células que se encuentra dentro de 60 mm placa de Petri. Empujar el tejido a través del filtro de células con el émbolo de una jeringa de 5 ml hasta obtener una suspensión de una sola célula se forma.
  2. La transferencia de la hepática única suspensión de células de la placa de Petri a un cónico de 50 ml con tapón de rosca del tubo y obtener un volumen total de 40 ml de frío tampón FACS.
  3. Vortex suspensión celular y tomar una parte alícuota de 1 ml para determinar la carga bacteriana por el hígado. Vaya al paso 7.3 y el uso de esta alícuota de 1 ml, en lugar de homogeneizado de tejido en la bolsa de Stomacher.
  4. Precipitar las células por centrifugación a 500 xg durante 5 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 40 ml de tampón FACS frío, que sedimenten las células por centrifugación a 500 xg durante 5 min a 4 ° C, y desechar el sobrenadante.
  5. Resuspender el botón celular en 20 ml de Percoll isotónico a temperatura ambiente. Centrifugar la suspensión celular a 700 g durante 12 minutos a temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante y hoja de disco como de células flotando en la superficie (es decir, los hepatocitos). Resuspender el pellet de leucocitos que contiene 4 ml de buffer de TAC para lisar los eritrocitos y las células se incuban a temperatura ambiente durante un máximo de 10 minutos con la inversión frecuentes.
  6. Suspensión de células a través de una membrana de filtro de 100 micras de nylon en un nuevo tubo de centrífuga de 10 ml.
  7. Subyacente filtrada suspensión de células con 1 ml de FCS / EDTA. Centrifugar a 350 g durante5 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante y se resuspenden en 5 ml FACS / EDTA.
  8. Centrifugar la suspensión celular a 350 g durante 5 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante, y resuspender el sedimento celular en 0,5-3 ml de FACS / EDTA en función del tamaño de la pastilla.
  9. 01:05-01:20 diluir la suspensión celular en azul tripán dependiendo del volumen de la suspensión en el paso 5.8. Contar leucocitos viables hepática con hemocitómetro (Figura 4) y determinar el total de células viables de la siguiente manera: las células viables / órgano = número de células en el factor de dilución área de conteo x 4 x 10 x volumen (ml). El hígado de una sola célula suspensiones puede ser marcadas con anticuerpos específicos para la deseada de la superficie celular los marcadores y analizada por FACS.

Consejos y notas:

  • Mantener las células en hielo a menos que se especifique lo contrario.

6. Preparación de una sola célula del bazo de suspensión para el análisis de FACS

  1. Generar una sola célula suspensiones mediante la colocación de una media del bazo (paso 4.7) con tampón FACS en un colador de 70 micras de células que se encuentra dentro de un plato de Petri de 60 mm. Empuje suavemente el tejido a través del filtro de células con el émbolo de una jeringa de 5 ml hasta obtener una suspensión de una sola célula se forma.
  2. Transferir el bazo única suspensión de células de la placa de Petri a un tubo de centrífuga de 10 ml y un volumen total de 10 ml con tampón FACS frío.
  3. Precipitar las células por centrifugación a 350 xg durante 5 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante, resuspender pellet de células en 4 ml de tampón TAC para lisar los eritrocitos y las células se incuban a temperatura ambiente durante un máximo de 10 minutos con la inversión frecuentes.
  4. Suspensión de células a través de una membrana de filtro de 100 micras de nylon en un nuevo tubo de centrífuga de 10 ml.
  5. Subyacente filtrada suspensión de células con 1 ml de FCS / EDTA. Centrifugar a 350 xg durante 5 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante, y resuspender el sedimento celular en 5 ml FACS / EDTA.
  6. Centrifugar la suspensión celular a 350 g durante 5 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante, y resuspender el sedimento celular en 3.8 mL FACS / EDTA en función del tamaño de la pastilla.
  7. Diluir 1:10 de células en suspensión - 1:20 en azul tripán (0,4% en agua destilada) dependiendo del volumen de la suspensión en el paso 7.6. Contar con esplenocitos viables con hemocitómetro - vea el Paso 5.9 para calcular el total de células viables por órgano del bazo de una sola célula suspensiones puede ser marcadas con anticuerpos específicos para la deseada de la superficie celular los marcadores y analizada por FACS.

Consejos y notas:

  1. Mantener las células en hielo a menos que se especifique lo contrario.

7. La medición de la carga bacteriana en los tejidos de ratones infectados con Listeria

  1. Doble la parte superior de la bolsa de Stomacher que contiene la mitad del bazo. Mientras se mantiene la bolsa Stomacher cerrada para evitar fugas, déjelo sobre un banco limpio o en una cabina de flujo laminar. Rollo de un picadero de espesor sobre el tejido hasta que el tejido se tritura dentro de la bolsa.
  2. Añadir 5 ml de PBS a cada bolsa Stomacher tejido que contiene puré. Coloque la bolsa en el Stomacher Stomacher, y ejecutar el Stomacher a alta velocidad durante 10 minutos.
  3. Mezclar el homogeneizado en la bolsa de Stomacher (o la alícuota de 1 ml de la suspensión de células hepáticas) con una pipeta. Realizar las siguientes en los duplicados. Transferencia de 300 L a una placa de 96 pocillos de fondo plano. Dentro de los pozos de la placa de 96 pocillos realizar diluciones seriadas 1:10 (30 l 270 l en PBS) a una dilución 10 -5 para cada muestra de tejido homogeneizado.
  4. Extiende con cuidado 0,1 ml de cada dilución en una placa de pre-secado HBA con un esparcidor de vidrio. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche.
  5. Cuente el número de UFC por cada dilución y calcular el UFC por tejido teniendo en cuenta la parte del tejido (por ejemplo medio del bazo), factor de dilución y el volumen total del homogeneizado de tejido (5 ml o 40 ml): UFC / tejido = CFU/0.1 ml x factor de dilución x ml / tejidos, por el bazo dividir este número por el peso porcentual de la muestra utilizada para la homogeneización del bazo tejido (véase el paso 4.7).

Consejos y observaciones:

  • Más de una bolsa Stomacher se puede colocar en el Stomacher a la vez, siempre y cuando el volumen total no exceda el volumen máximo especificado por el fabricante
  • Si un Stomacher no está disponible, un homogeneizador de tejidos se pueden utilizar en su lugar. Por otra parte, el siguiente método, aunque no son tan eficientes, también se puede utilizar para macerar manualmente el órgano en el lugar de los pasos 7.1 y 7.2: órgano lugar en un sobre sellado bolsa de plástico esterilizada y se echó en un banco limpio mientras se mantiene la bolsa cerrada para evitar fugas . Rollo de 500 ml botella de vidrio de laboratorio repetidamente sobre la bolsa hasta que el tejido esté bien triturado. Añadir 5 ml de PBS a cada bolsa y vaya al paso 7.3.
  • Es muy importante en el paso 7.4 que las placas HBA se secan completamente(Es decir, no hay humedad en el agar). De lo contrario, puede ser difícil de obtener distintas colonias de Listeria que puede ser contado correctamente.
  • Si hay un número limitado placas HBA, un paso alternativo 7.4 es: Dibujar líneas en la parte inferior de una placa de pre-secado HBA (Paso 1.1) para dividirlo en cinco a seis secciones, una para cada dilución. Cuidadosamente con una pipeta 25 l de cada dilución en secciones correspondientes en la placa HBA para cada homogeneizado de tejido - no se propagan con una espátula. Espere hasta que las gotas de homogeneizado de tejido se seca antes de invertir la placa. Incubar la placa a 37 ° C durante la noche. Hasta 80 colonias se pueden distinguir por una gota en una placa de agar.
  • Dilución de los homogeneizados de tejido puede depender del crecimiento de Listeria en el animal y se puede estimar sobre la base de que los síntomas mostrados por el animal en el momento de la eutanasia. En los ratones que son notablemente moribunda, entonces diluciones adicionales pueden ser necesarios para determinar con mayor precisión la carga bacteriana. De los ratones inoculados con dosis bajas de Listeria o ratones sacrificados al final del periodo de infección, homogeneizado de tejido sin diluir se puede utilizar para determinar la carga bacteriana.
  • Las placas pueden ser incubadas a 37 ° C durante la noche oa temperatura ambiente durante 2-3 días.

8. Los resultados representativos:

Para un experimento de infección estándar, Listeria fue obtenida de una reserva de glicerol congelado y sembradas en una placa HBA como se muestra en la Figura 1. Si algunas colonias se obtienen después de rayas, esto puede indicar rayas pobres o menos de stock congelado óptima. Una acción infecciosa Listeria se preparó a partir de una placa HBA recién rayado y se almacenan a -70 ° C. Para la medición de la eliminación de bacterias y la respuesta inmune, de manera rutinaria diluir el descongelado acciones infecciosa Listeria a 2.500 UFC / ml - 15.000 UFC / ml y se inyectan ratones con 200 l para infectarlos con 500 - 3.000 UFC. Observamos que los ratones infectados con dosis subletales de Listeria con este protocolo de forma transitoria pueden presentar pelaje rizado, postura encorvada y la pérdida de peso en los primeros días. Estos síntomas proporcionar una señal visual en cuanto a la severidad con un ratón individual se ve afectada por la infección, si se responde de manera diferente al resto del grupo (es decir, "evidente" outlier), y si la eutanasia es necesaria para evitar un sufrimiento excesivo y la muerte inminente debido a la infección.

En los resultados representados en las figuras 2-5, los ratones fueron infectados con una alícuota recién descongelado de las acciones infecciosa Listeria. En diferentes momentos después de la infección, los ratones fueron sacrificados y el hígado y el bazo fueron removidos. La figura 2 muestra una placa HBA en el que se cultivó homogeneizado diluido el bazo de un ratón. Debe haber una clara reducción en el número de colonias como el factor de dilución es mayor, de tal manera que contando UFC distinta es posible que al menos dos diluciones. Si el ratón se ha eliminado la infección por Listeria (límite de detección, es decir = 100 UFC / tejido), entonces <5 colonias de Listeria estará presente en la placa HBA que se extendió con 200 l de homogeneizado de tejido sin diluir. Si el hígado y / o el bazo se contaminan con bacterias externas intestinal o de otro tipo durante el aislamiento, las colonias en la placa HBA es probable que exhiben morfología diferente (es decir, no tienen aureola característica y color pálido de las colonias de Listeria) y / o se puede diferentes en el recuento de colonias a lo que se espera para Listeria (es decir, muy pocos o demasiados). La Figura 3 muestra una curva típica de autorización Listeria en ratones C57BL / 6 - Listeria en cuenta que normalmente se eliminan más rápidamente del bazo que el hígado y que la remoción no se produce hasta cinco días después de la infección.

La Figura 4 muestra el recuento de células sobre la base de una sola célula suspensiones preparadas a partir de bazo y el hígado de los ratones infectados en diferentes momentos después de la infección. Este método puede alcanzar> 95% de pureza de leucocitos en una sola célula suspensiones preparadas a partir de hígado y> 80% del bazo. La pureza de leucocitos puede ser determinada por el análisis FACS utilizando un anticuerpo monoclonal específico para el marcador pan-leucocitario CD45 (clon 30-F11). Normalmente, el número de esplenocitos y leucocitos hepática aumento durante el período que se tarda en eliminar la infección con el hígado presentan un mayor aumento en los leucocitos veces hepática, pero un total considerablemente menor, en comparación con el aumento de esplenocitos en el bazo. El tipo y número de las células inmunes se puede determinar mediante el etiquetado, las suspensiones de una sola célula con anticuerpos específicos para los marcadores de la superficie celular. Células marcadas se puede detectar mediante análisis de FACS. La Figura 5 ofrece resultados representativos de células T CD8 +. Durante una infección por Listeria estándar en ratones C57BL / 6, el número de células T CD8 + transitoriamente disminuye debido a la linfopenia en el bazo en los días 2-3 before incrementar notablemente desde el día 5 después de la infección, tanto en el bazo y el hígado.

Figura 1
Figura 1. Placa HBA rayado con Listeria. Un bucle de inoculación estéril se utilizó para racha de Listeria a partir de un stock de glicerol congelado. La placa se incubó a 37 ° C durante la noche. El halo alrededor de las colonias características individuales se debe a la β-hemólisis.

Figura 2
Figura 2. Tejido homogeneizado de un ratón Listeria infectadas cultivadas en placas de HBA. El hígado fue extraído de un C57BL Listeria infectados / ratón 6 a los 3 días post-infección. Homogeneizado de tejido fue preparado y colocado diluciones de 100 l placa completa difusión de dilución 10 -4 (A) y 10 -5 dilución (B), así como 25 gotas l en una placa HBA para cada dilución de 1:10 de diluir a 10 -5 (C). Las placas se incubaron a 37 º C durante la noche. Las diluciones que permitan el recuento de colonias individuales se utilizan para determinar la carga bacteriana (es decir, UFC / tejido) en ese punto en el tiempo post-infección.

Figura 3
Figura 3. Listeria carga en el bazo y el hígado de los ratones infectados C57BL / 6 a 3 y 7 días post-infección. Ratones C57BL / 6 fueron infectados con ~ 2000 UFC de Listeria. En cada momento, los ratones fueron sacrificados, el hígado fue perfundido y se cosecha con el bazo, y las diluciones del homogeneizado esplénico (A) o hepática única suspensión de células (B) se cultivaron en placas HBA para determinar la carga bacteriana. Las líneas continuas indican la media geométrica, y las barras verticales indican SEM. La línea punteada indica que el límite de detección para una medición precisa de la carga bacteriana es de 100 UFC / órgano de este experimento.

Figura 4
Figura 4. Recuento de células viables para los tejidos de los ratones infectados. Ratones C57BL / 6 fueron infectados con ~ 2000 UFC de Listeria. En cada momento, los ratones fueron sacrificados y perfundidos el hígado y se cosecha con el bazo. Las células se tiñeron con azul de tripano y contó con un hemocitómetro como se describe en el Paso 5.9 (A). Esplenocitos de leucocitos (B) y hepática (C) recuentos obtenidos a partir de una sola célula suspensiones preparadas a partir de ratones infectados con Listeria. Las líneas indican la media geométrica.

Figura 5
Figura 5. FACS análisis de células T CD8 + en ratones infectados con Listeria. Ratones C57BL / 6 fueron infectados con ~ 2000 UFC de Listeria. En cada momento, los ratones fueron sacrificados y perfundidos el hígado y se cosecha con el bazo. Una sola célula suspensiones fueron teñidas con anticuerpos específicos para las células T (CD3, TCRβ, CD4 y CD8). (A) Representante de los perfiles de FACS con% linfocitos T CD8 + + / - SEM. (B) Total de células T CD8 + en el bazo. (C) Total de células T CD8 + en el hígado.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Anna Walduck, Cheers Christina, Berzins Stuart, Godfrey Dale, Zhan Yifan y Wilksch Jonathan para el asesoramiento y los reactivos. Este trabajo fue financiado por la Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2008-602) y Salud Nacional de Australia y el Consejo de Investigación Médica (575552). NO es compatible con un premio de Postgrado en Australia. OW es apoyado por una beca de RD Wright de la Australian National Health Medical Research Council.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Horse blood agar base No.2 Oxford Labware CM0271 Preparation of agar base for HBA plates
Horse blood (defibrinated) Oxford Labware HB1000 Add 5-10% to agar base
Brain heart infusion (BHI) broth (10 mL) Oxford Labware TM456
Brain heart infusion dehydrated media Oxford Labware CM1135
96-well flat bottom plate BD Biosciences 353072
70 μm cell strainer BD Biosciences 352350
Small petri dish BD Biosciences 351007
Stomacher 80 biomaster lab system Seward
Plastic Stomacher bags Sarstedt Ltd 86 9924 530
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3912
FACS buffer 0.1% (w/v) bovine serum albumin in PBS
Isotonic Percoll (33.75% Percoll in PBS) GE Healthcare 17-0891-01 33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, 62.5mL 1x PBS makes 100mL isotonic Percoll
TAC Buffer 17mM Tris, 140mM ammonium chloride in distilled water
FCS/EDTA buffer Fetal calf serum with 10mM EDTA
FACS/EDTA buffer FACS buffer + 5mM EDTA
Trypan blue Sigma-Aldrich T6146 0.4% (w/v) in PBS, filter sterilized
2mL Cryovial Greiner Bio-One 121263
27 gauge/1mL insulin syringe Terumo Medical Corp. SS10M2713
Needle Terumo Medical Corp. NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in)
Syringe Terumo Medical Corp. SS-01T (1mL), SS-053 (5mL), SS-10S (10mL)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wing, E. J., Gregory, S. H. Listeria monocytogenes: clinical and experimental update. J Infect Dis. 185, Suppl 1. S18-S24 (2002).
  2. Conlan, J. W. Early host-pathogen interactions in the liver and spleen during systemic murine listeriosis: an overview. Immunobiology. 201, 178-187 (1999).
  3. Neuenhahn, M., Busch, D. H. Unique functions of splenic CD8alpha+ dendritic cells during infection with intracellular pathogens. Immunol Lett. 114, 66-72 (2007).
  4. Cousens, L. P., Wing, E. J. Innate defenses in the liver during Listeria infection. Immunol Rev. 174, 150-159 (2000).
  5. Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
  6. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4, 812-823 (2004).
  7. Cheers, C., McKenzie, I. F. Resistance and susceptibility of mice to bacterial infection: genetics of listeriosis. Infect Immun. 19, 755-762 (1978).
  8. Garifulin, O., Boyartchuk, V. Listeria monocytogenes as a probe of immune function. Brief Funct Genomic Proteomic. 4, 258-269 (2005).
  9. Gervais, F., Stevenson, M., Skamene, E. Genetic control of resistance to Listeria monocytogenes: regulation of leukocyte inflammatory responses by the Hc locus. J Immunol. 132, 2078-2083 (1984).
  10. Gervais, F., Desforges, C., Skamene, E. The C5-sufficient A/J congenic mouse strain. Inflammatory response and resistance to Listeria monocytogenes. J Immunol. 142, 2057-2060 (1989).
  11. Boyartchuk, V. L. Multigenic control of Listeria monocytogenes susceptibility in mice. Nat Genet. 27, 259-260 (2001).
  12. Boyartchuk, V. The host resistance locus sst1 controls innate immunity to Listeria monocytogenes infection in immunodeficient mice. J Immunol. 173, 5112-5120 (2004).
  13. Pan, H. Ipr1 gene mediates innate immunity to tuberculosis. Nature. 434, 767-772 (2005).
  14. Garifulin, O. Irf3 polymorphism alters induction of interferon beta in response to Listeria monocytogenes infection. PLoS Genet. 3, 1587-1597 (2007).
  15. Hof, H. Virulence of different strains of Listeria monocytogenes serovar 1/2a. Med Microbiol Immunol (Berl. 173, 207-218 (1984).
  16. Wollert, T. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129, 891-902 (2007).
  17. Lecuit, M. A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. 292, 1722-1725 (2001).
  18. Marco, A. J. Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route. Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).
  19. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes. Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).
  20. Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. DCs in mouse models of intracellular bacterial infection. Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).
  21. Conlan, J. W., North, R. J. Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody. J Exp Med. 179, 259-268 (1994).
  22. Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice. Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).

Tags

Inmunología Número 54 la bacteria listeria intracelular la susceptibilidad genética el hígado el bazo la sangre el análisis de FACS las células T
La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con<em> Listeria monocytogenes</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, N., Strugnell, R., Wijburg,… More

Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (54), e3076, doi:10.3791/3076 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter