Summary
على الرغم من التطورات الأخيرة في التعديل الوراثي، ترنسفكأيشن من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESCs) لا تزال عملية متقلبة. على حد علمنا، لم أساليب منهجية وفعالة لبالنقل الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان خلايا (iPSCs) للأنباء. هنا، نحن تصف بروتوكولات قوية لبالنقل بكفاءة وnucleofect iPSCs الإنسان.
Abstract
التعديل الوراثي هو استمرار لتكون أداة أساسية في دراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية ويبين في التطبيقات السريرية المحتملة للخلايا الجذعية الجنينية (HESCs) 1. في حين وصفت العديد من التحسينات في طرق إيصال الجين 2-9، ترنسفكأيشن لا تزال متقلبة لعملية HESCs، وحتى الآن لم يتم الإبلاغ عن صنع الإنسان في الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs). في هذا الفيديو، ونحن لشرح كيفية مختبرنا transfects بشكل روتيني وnucleofects iPSCs الإنسان باستخدام البلازميد مع تعزيز مضان مراسل الأخضر (EGFP) البروتين. يتم تكييفها iPSCs الإنسان والحفاظ عليه المغذية خالية الثقافات للقضاء على إمكانية ترنسفكأيشن الخلية المغذية والسماح اختيار كفاءة مستقرة استنساخ اللجنة التوجيهية المعدلة وراثيا بعد ترنسفكأيشن. لnucleofection، وiPSCs الإنسان مسبقا تعامل مع مثبط ROCK 11، trypsinized إلى كتل صغيرة من الخلايا، وnucleofected replated على مغذيات في الخلية المغذية للهواءالمتوسطة لزيادة الانتعاش الخلية. ويمكن الحصول على التحوير، معربا عن iPSCs الإنسان بعد 6 ساعات. يتم تطبيق اختيار المضادات الحيوية بعد 24 ساعة وخطوط مستقرة المعدلة وراثيا تظهر ضمن 1 أسبوع. بروتوكول لدينا قوية وقابلة للتكرار لخطوط التوجيهية الإنسان دون تغيير تعدد القدرات من هذه الخلايا.
Protocol
بروتوكول لدينا يبدأ مع طريقة للتكيف مع iPSCs الإنسان على الثقافات المغذية خالية، تليها بروتوكولات لiPSCs بنقل العدوى إلى الإنسان باستخدام GeneJuice (EMD) وnucleofection من iPSCs الإنسان باستخدام جهاز nuclefector AMAXA.
ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراءات التالية في غطاء تدفق الصفحي العقيمة. جميع وسائل الإعلام والحلول معايرتها إلى 37 ° C أو درجة حرارة الغرفة قبل البدء ما لم ينص على خلاف ذلك.
1. إنشاء iPSCs الإنسان على التغذية خال من نظام
يمكن تقسيم المحافظة iPSCs الإنسان سابقا على الخلايا المغذية، نقل على Geltrex المغلفة طبق ويحتفظ به لاثنين من الممرات قبل المغذية خالية ترنسفكأيشن.
- ذوبان الجليد بين عشية وضحاها في Geltrex C. ° 4 لإعداد Geltrex طلاء، تمييع مطلق Geltrex 1:50 في DMEM الباردة. مزيج الحلول بلطف.
ملاحظة: Geltrex، مثل Matrigel هو شكل قابل للذوبان من matr الغشاء القاعديتاسعا تنقيته من الفئران Engelbreth-هولم-سرب الخلايا السرطانية (EHS). وبدلا من ذلك، يمكن استخدام Matrigel باعتبارها مصفوفة خارج الخلية لإنشاء وحدة التغذية الخالية من الثقافات اللجنة التوجيهية الإنسان.
- تغطية كاملة من الآبار السطحية الثقافة مع الحل Geltrex (1 مل 35-جيدا لمم أ). معطف الآبار مع Geltrex في 37 ° C الحاضنة لمدة 1 ساعة.
- لiPSCs مرور الإنسان، إضافة 1 مل من accutase لكل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة حتى تبدأ معظم الخلايا لفصل.
لiPSCs مرور الإنسان، إضافة 1 مل من accutase لكل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة حتى تبدأ معظم الخلايا لفصل.
- إضافة الخرز الزجاجي 10-15 إلى الخلايا ودوامة بلطف لوحة. إضافة 2 مل من DMEM خروج المغلوب / F12 ويسحن بلطف. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 10 مل.
- تدور في 800 دورة في الدقيقة الخلايا لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نضح طاف من الأنبوب، وترك الإنسان اللجنة التوجيهية بيليه سليمة. نفض الغبار بلطف أنبوب لتفريق الخلية بيليه.
- إزالة Geltrex من البئر المغلفة.
- إعادة تعليق بيليه اللجنة التوجيهية بلطف الإنسان في حجم مناسب لSTEMPRO. توزيع بين آبار مغذيات، تبعا لمعدل انتشار). يمكن passaged iPSCs الإنسان في نسبة انقسام 1:02 حتي 01:06.
- بعناية مكان إلى 5٪ CO 2 حاضنة لوحة دوامة بعناية لضمان توزيع عادل للخلايا عبر الآبار.
- الخلايا الأعلاف يوميا حتى الخلايا جاهزة للتقسيم مرة أخرى (عندما الخلايا يصل إلى 80٪ confluency).
- iPSCs مرور الإنسان على بئر جديدة Geltrex المغلفة (الخطوة 1،3 حتي 1،9) في نسبة انقسام 1:2. ينبغي تشكيل مستعمرات صغيرة وموزعة بالتساوي على Geltrex المغلفة جيدا قبل ترنسفكأيشن.
2. ترنسفكأيشن من iPSCs الإنسان مع GeneJuice
ينبغي الخلايا (نمت على 6 لوحات جيدا) يكون حوالي 40 -50٪ متموجة في يوم ترنسفكأيشن لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة ترنسفكأيشن. فمنليس من الضروري تغيير المتوسطة الخلية حتى في اليوم التالي.
- إعداد 100 ميكرولتر KO-DMEM/F12 في أنبوب إيبندورف العقيمة 1،5 مل. إضافة 27 ميكرولتر ترنسفكأيشن GeneJuice كاشف. تخلط جيدا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 4 DNA البلازميد ميكروغرام. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. اختيار البلازميد أمر بالغ الأهمية لتحقيق الكفاءة المثلى ترنسفكأيشن. نستخدم البلازميد مع البروتين الأخضر مضان محسن (EGFP) يقودها المساعدة النقدية المروج 5 (pCAG-EGFP). المساعدة النقدية المروج هو المروج القوية التي تنشط في transcriptionally iPSCs الإنسان، وبالتالي يمكن استخدامها لدفع التعبير التحوير في هذه الخلايا. في أيدينا، لم الخطية من البلازميد لا يبدو أنها تؤثر على كفاءة ترنسفكأيشن.
- إضافة GeneJuice-DNA إلى الخلايا خليط ودوامة لوحة. تدور في 1200 دورة في الدقيقة لوحة لمدة 5 دقائق (طريقة 'spinoculation') لزيادة الاتصال من خليط ترنسفكأيشن مع iPSCs الإنسان على البئر.
- احتضان الخلايا في 37 ودرجة؛ C بين عشية وضحاها.
- رصد لكفاءة ترنسفكأيشن في اليوم التالي.
- لترنسفكأيشن مستقرة، تغيير المتوسطة في اليوم التالي مع STEMPRO الطازجة. إضافة اختيار المضادات الحيوية المناسبة بعد 24 - 48 ساعة.
3. Nucleofection من iPSCs الإنسان
ويمكن استخدام iPSCs الإنسان نمت على مغذيات أو Geltrex لnucleofection. ومع ذلك، فإننا نوصي بشدة replating iPSCs الإنسان على الخلايا الليفية الماوس nucleofected الجنينية (MEF) أو الخلايا الليفية الإنسان القلفة (HFF) مغذيات عالية لضمان بقاء الخلية والانتعاش. وينبغي أن تستخدم على الأقل 2 مليون خلية لتحقيق أعلى بقاء الخلية بعد nucleofection.
- إعداد تغذية خلايا وسائل الإعلام مكيفة (CM) من خلال احتضان خروج المغلوب اللجنة التوجيهية الإنسان مصل استبدال (KOSR) وسائل الاعلام مع الخلايا المغذية ليلة وضحاها. CM جمع كل 24 ساعة.
ملاحظة: أي سلالة الماوس المستخدمة لإعداد طبقات المغذية (مثل CF1، وBLK6 MF1) هو مناسبة لاستخدامها FOص صنع CM.
- في يوم nucleofection، قبل علاج iPSCs الإنسان مع 10 ميكرومتر ROCK المانع لمدة لا تقل 1 ساعة.
- إعداد 82 ميكرولتر من الخلايا الجذعية البشرية في حل nucleofector العقيمة 1،5 مل أنبوب إيبندورف. إضافة 18 ميكرولتر الملحق 1. تخلط جيدا. احتضان حل في C ° 37 لمدة 5 دقائق.
- قبل الدافئة تغذية الخلايا مكيفة وسائل الإعلام (CM) و0.25٪ التربسين / EDTA إلى 37 ° C. تحت غطاء محرك السيارة، prelabel 1 عقيمة أنبوب 15 مل المخروطية.
- إزالة بعناية وسائل الإعلام من ثقافة الإنسان أن اللجنة التوجيهية nucleofected. يغسل بلطف الخلايا مع 2 مل حل الفوسفات مخزنة 1X (PBS) لكل بئر. نضح في برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من التربسين 0.25٪ لكل بئر. احتضان خلايا في C ° 37 لمدة 3 دقائق.
- يسحن بلطف خلايا ماصة الحافة مع 1000 مل. غسل قاع البئر للتأكد من منفصلة تماما عن iPSCs الإنسان. نقل تعليق الخلية في أنبوب 15 مل المخروطية المسمى.
ملاحظة: Trypsinization في ج واحدوينبغي بدقة ells يمكن تجنبها. يجب فقط أن الخلايا فكها إلى كتل صغيرة من الخلايا تتكون من ثلاثة توائم تقريبا من الخلايا. وكتل صغيرة من الخلايا (مثلثات الخلية) يمكن فصلها إلى خلايا واحدة خلال التعامل مع لاحقة من الخلايا.
- أضف 9 مل وسائل الإعلام MEF لتعطيل التربسين. تدور الخلايا في 800 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. نضح بعناية طاف وترك الخلية بيليه سليمة.
- إعادة تعليق الخلايا في ميكرولتر 100 من prewarmed الإنسان الجذعية حل الخلية nucleofector من الخطوة 3.3.
- نقل الخلايا إلى كوفيت nucleofector باستخدام (أ) 1 مل ماصة الحافة.
- إضافة 4 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في التعليق خلية في كوفيت. مزيج من الخلايا والحمض النووي دوامات لطيف. اضغط على كوفيت مرتين على سطح غطاء محرك السيارة.
- إدراج كوفيت في ماسك nucleofector. استخدام برامج B-016. Nucleofect الخلايا عن طريق الضغط على زر X.
<
- استرداد خلايا nucleofected من كوفيت باستخدام ماصة بلاستيكية تقديم باستور. استعادة الخلايا عن طريق resuspending لهم في CM prewarmed ومثبط ROCK في أنبوب إيبندورف العقيمة 1،5 مل. احتضان خلايا في C ° 37 لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا التعافي.
- نقل الخلايا قطرة من الحكمة على طبقات التغذية باستخدام 1 تلميح ماصة مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- رصد لكفاءة ترنسفكأيشن في اليوم التالي. لاستخلاص الحيوانات المستنسخة مستقرة من iPSCs الإنسان المعدلة وراثيا أن التعبير عن ثابت التحوير، تغيير المتوسطة في اليوم التالي مع CM ومثبط ROCK. إضافة اختيار المضادات الحيوية المناسبة بعد 24 - 48 ساعة.
4. ممثل النتائج:
Discussion
لدينا بروتوكولات نتيجة في تقنيات بسيطة وقوية للغاية وقابلة للتكرار لإدخال جينات منقولة في iPSCs الإنسان دون تأثير سام بارزة وموت الخلايا. وينبغي passaged iPSCs الإنسان إلى أصغر كتل من الخلايا (خلايا 5-10) ومطلي على Geltrex في كثافة عالية (1:2) لضمان كفاءة ترنسفكأيشن الأمثل في مستعمرات صغيرة عديدة. اللجنة التوجيهية لخطوط الإنسان التي هي أكثر عرضة للموت الخلية التمايز و، ينبغي استخدام عدد أكبر من iPSCs الإنسان (تصل إلى 4 X 10 6 خلايا) لتجربة nucleofection واحد. مقايسة عابرة ترنسفكأيشن يولد أعداد كبيرة من iPSCs التحوير، معربا عن الإنسان داخل 1 يوم. استنساخ اللجنة التوجيهية ستابلي تظهر عادة في غضون 7 أيام، وهذه المستعمرات المعدلة وراثيا يجب أن تكون جاهزة ويمكن الحصول عليها في غضون ثلاثة أسابيع. وصف استخدام المروج CAG هنا يضمن التعبير في كل مكان من مراسل EGFP. تحت هذه التحسينات، يمكن تناول بروتوكولات لدينا في التطبيقات الأخرى، بما في ذلك overexpression، جonditional التعريفي، والاشتقاق من خطوط سلالته مراسل محددة، أو ضربة قاضية سيرنا shRNA، إعادة التركيب الجيني الاستهداف ومثلي.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
العمل المبين في هذا المخطوط كان ممكنا من خلال تمويل من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) لUCR الجذعية الأساسية الخلية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Glass beads should be washed with hydrochloric acid (HCl) overnight, rinsed off with sodium hydroxide (NaOH) and distilled water, and sterilized by autoclave before use. |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0263 | |
| DMEM (high glucose) | Lonza Inc. | 12-741 F | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Geltrex | Invitrogen | 12760013 | Growth factor reduced |
| GeneJuice transfection reagent | EMD Millipore | 70967 | |
| Glutamax-I (100X) | Invitrogen | 35050061 | L-Glutamine (Invitrogen, 25030081) can also be used instead. |
| Human iPSC KOSR media | 500 ml human ES media consists of 390 ml KnockOut DMEM/ F12, 100 ml KnockOut Serum Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. | ||
| KnockOut DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | |
| KnockOut Serum Replacement (KOSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| Mouse embryonic fibroblast media | MEF media consists of 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I and 1X sodium pyruvate in DMEM (high glucose) | ||
| Non essential amino acid, NEAA?(100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| Human stem cell nucleofector solution 1 with supplement | Lonza Inc. | VAPH-5012 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Invitrogen | 10010023 | |
| Sodium pyruvate (100X) | Invitrogen | 11360070 | |
| STEMPRO medium kit | Invitrogen | A1000701 | 500 ml STEMPRO media consists of 454 ml KnockOut DMEM/ F12, 10 ml STEMPRO serum-free growth supplement (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml BSA (Bovine serum albumin, 25%), 909 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. |
References
- Liew, C. G. Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation. Ann Med. 37, 521-532 (2005).
- Eiges, R. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homogous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).
- Siemen, H. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
- Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives. Stem Cells. 26, 525-533 (2008).
- Braam, S. R. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).
- Braam, S. R. Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification. Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).
- Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).
- Placantonakis, D. G. BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage. Stem Cells. 27, 521-532 (2009).
