Summary
Ondanks de recente ontwikkelingen in genetische modificatie, transfectie van humane embryonale stamcellen (hESC 's) blijft een grillig proces. Voor zover wij weten, zijn systematische en efficiënte methoden om menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) transfecteren niet gemeld. Hier beschrijven we robuuste protocollen om efficiënt te transfecteren en nucleofect menselijke iPSCs.
Abstract
Genetische modificatie blijft een essentieel instrument zijn in het bestuderen van stamcel biologie en in het formuleren van mogelijke klinische toepassingen van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) 1. Hoewel verbeteringen in verschillende gentherapie werkwijzen beschreven 2-9, transfectie blijft een grillig proces voor hESC 'en nog niet gemeld in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). In deze video laten we zien hoe ons lab routinematig transfects en nucleofects menselijke iPSCs met behulp van plasmide met een verbeterde groene fluorescentie eiwit (eGFP) verslaggever. Human iPSCs aangepast en worden bewaard feeder-free culturen de mogelijkheid feeder celtransfectie heffen en efficiënte selectie van stabiele transgene iPSC klonen na transfectie mogelijk. Voor nucleofectie worden menselijke iPSCs voorbehandeld met ROCK inhibitor 11, getrypsiniseerd in kleine groepjes van cellen, nucleofected en opnieuw uitgeplaat op feeders in feeder cel-geconditioneerdemedium naar cel herstel te verbeteren. Transgen-expressie menselijke iPSCs kan worden verkregen na 6 uur. Antibioticumselectie toegepast na 24 uur en stabiele transgene lijnen binnen 1 week. Het protocol is robuust en reproduceerbaar voor menselijke iPSC lijnen zonder dat pluripotentie van deze cellen.
Protocol
Ons protocol begint met een methode om menselijke iPSCs aan te passen aan feeder-vrije culturen, gevolgd door protocollen voor het transfecteren menselijke iPSCs met GeneJuice (EMD) en nucleofectie van menselijke iPSCs met behulp van een AMAXA nuclefector apparaat.
Opmerking: De volgende procedures worden uitgevoerd in een steriele laminaire stroming kap. Alle media en oplossingen geëquilibreerd tot 37 ° C of kamertemperatuur voordat tenzij anders aangegeven.
1. Tot oprichting van de menselijke iPSCs op feeder-vrij systeem
Human iPSCs ervoor zorgde dat op feeder-cellen kan worden gesplitst, overgebracht naar Geltrex-gecoate schaal en gedurende twee passages voorafgaand aan de feeder-vrij transfectie.
- 'S nachts ontdooien Geltrex bij 4 ° C. Om Geltrex coating voor te bereiden, te verdunnen ontdooid Geltrex 1:50 in koude DMEM. Meng de oplossingen voorzichtig.
Opmerking: Geltrex, zoals Matrigel is een oplosbare vorm van basaal membraan matrix gezuiverd uit murine Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tumorcellen. Als alternatief kan Matrigel worden gebruikt als extracellulaire matrix feeder-vrije menselijke iPSC culturen vastgesteld.
- Het gehele oppervlak van kweekputjes met Geltrex oplossing (1 ml voor een 35-mm well). Coat putjes met Geltrex bij 37 ° C incubator gedurende 1 uur.
- Om passage menselijke iPSCs, voeg 1 ml van Accutase per putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 min tot de meeste cellen beginnen te verwijderen.
Om passage menselijke iPSCs, voeg 1 ml van Accutase per putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 min tot de meeste cellen beginnen te verwijderen.
- Voeg 10 tot 15 glasparels aan de cellen en voorzichtig zwenken de plaat. Voeg 2 ml KnockOut DMEM / F12 en voorzichtig vermalen. Breng celsuspensie in een 10 ml centrifugebuis.
- Spin cellen bij 800 rpm gedurende 3 min bij kamertemperatuur.
- Zuig supernatant van de buis, waardoor menselijke iPSC pellet intact. Tik eerst zachtjes tegen buisverspreiden celpellet.
- Geltrex verwijderen van de beklede put.
- Voorzichtig resuspendeer menselijke IPSC pellet in een geschikt volume van STEMPRO. Verdelen tussen putjes van feeders, afhankelijk van de proliferatiesnelheid). Human iPSCs worden gepasseerd in een gescheiden verhouding van 1:2 tot 1:6.
- Voorzichtig plaats in 5% CO 2 incubator, wervelen de plaat voorzichtig naar een gelijkmatige verdeling van cellen over de putten te garanderen.
- Feed cellen dagelijks tot cellen zijn klaar om opnieuw te worden gesplitst (wanneer de cellen oplopen tot 80% confluentie).
- Passage menselijke iPSCs op nieuwe Geltrex-beklede put (stap 1,3 tot 1,9) in een gescheiden verhouding van 1:2. Kleine kolonies worden gevormd en gelijkmatig verdeeld Geltrex-beklede put voor transfectie.
2. Transfectie van menselijke iPSCs met GeneJuice
Cellen (gekweekt op 6-well platen) moet ongeveer 40 -50% confluent op de dag van transfectie optimale transfectie efficiëntie te bereiken. Het isniet nodig om de cel te veranderen medium tot de volgende dag.
- Bereid 100 ul KO-DMEM/F12 in een steriele 1,5 ml Eppendorf buis. Voeg 27 ul GeneJuice transfectie reagens. Meng goed. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voeg 4 pg plasmide DNA. Incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. De keuze van plasmide essentieel is voor optimale transfectie-efficiëntie. We gebruiken een plasmide met een versterkt groen fluorescentie eiwit (eGFP) aangedreven door CAG promotor 5 (pCAG-eGFP). CAG promoter is een sterke promoter die transcriptioneel actief in humane iPSCs en kan dus worden gebruikt om transgene expressie in deze cellen te sturen. In onze handen heeft linearisatie van plasmide niet te transfectie-efficiëntie beïnvloeden.
- Voeg GeneJuice-DNA aan de cellen en zwenk de plaat. Draai de plaat bij 1200 rpm gedurende 5 minuten (spinoculation-methode) om het contact van transfectiemengsel toenemen menselijke iPSCs op de put.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C overnacht.
- Monitor voor transfectie-efficiëntie de volgende dag.
- Voor stabiele transfectie, wijzigt medium de volgende dag met verse STEMPRO. Voeg het juiste antibiotische selectie na 24 - 48 uur.
3. Nucleofectie menselijke iPSCs
Human iPSCs geteeld op feeders of Geltrex kan worden gebruikt voor nucleofectie. Echter, we raden replating nucleofected menselijke iPSCs op muis embryonale fibroblasten (MEF) of humane voorhuid fibroblast (HFF) feeders tot hoge levensvatbaarheid van de cellen en terugwinning. Minstens 2 miljoen cellen worden gebruikt om een hoger celoverleving na nucleofectie bereiken.
- Bereid feeder-cel geconditioneerde media (CM) door het incuberen van de menselijke IPSC KnockOut Serum Vervanging (KOSR) media met feeder cellen gedurende de nacht. Verzamel CM elke 24 uur.
Opmerking: Alle muizenstam voor het bereiden voedsterlagen (zoals BLK6, CF1 en MF1) geschikt voor gebruik for CM maken.
- Op de dag van nucleofectie, behandel menselijke iPSCs met 10 uM ROCK inhibitor ten minste 1 uur.
- Bereid 82 gl humane stamcellen nucleofector oplossing in een steriele 1,5 ml Eppendorf buis. Voeg 18 ul supplement 1. Meng goed. Incubeer oplossing bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Voorverwarmen feeder cell-geconditioneerde media (CM) en 0,25% trypsine / EDTA tot 37 ° C. Onder de motorkap, prelabel een steriele 15 ml conische buis.
- Verwijder voorzichtig papier uit de menselijke IPSC cultuur te nucleofected. Voorzichtig wassen van de cellen met 2 ml 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) per well. Zuig het PBS. Voeg 1 ml van 0,25% trypsine per well. Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 3 minuten.
- Voorzichtig Vermaal de cellen met 1000 ml pipet tip. Was de bodem van de put om te controleren of alle menselijke iPSCs zijn volledig vrijstaand. Breng celsuspensie met de gelabelde 15 ml conische buis.
Opmerking: behandeling met trypsine in single cel moet strikt worden vermeden. Cellen alleen worden verplaatst in kleine klompen cellen bestond uit ongeveer tripletten van cellen. Kleine massa's van cellen (cel triples) zal worden gedissocieerd in enkele cellen tijdens de daaropvolgende behandeling van de cellen.
- Voeg 9 ml MEF media trypsine te inactiveren. Spin cellen bij 800 rpm gedurende 3 minuten. Zorgvuldig aspireren het supernatans en laat de cel pellet intact.
- Resuspendeer cellen in 100 ul voorverwarmde humane stamcellen nucleofector oplossing van Stap 3.3.
- Overdracht cellen om een nucleofector cuvet met behulp van een 1 ml pipet tip.
- Voeg 4 pg plasmide DNA in de celsuspensie in de cuvette. Meng cellen en DNA door zachte wervelende. Tik tweemaal op de kuvet op de motorkap oppervlak.
- Plaats de cuvet in de nucleofector houder. Gebruik programma's B-016. Nucleofect cellen door te drukken op de knop X.
<
- Ophalen nucleofected cellen van de kuvet met behulp van de meegeleverde Pasteur plastic pipet. Recover cellen door resuspenderen ze in voorverwarmde CM en ROCK inhibitor in een steriele 1,5 ml Eppendorf buis. Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 10 minuten te laten herstellen cellen.
- Transfer cellen druppelsgewijs op feeder lagen met behulp van 1 ml pipet tip. Incubeer de cellen bij 37 ° C geroerd.
- Monitor voor transfectie-efficiëntie de volgende dag. Voor de berekening van stabiele klonen van transgene menselijke iPSCs dat stabiel tot expressie transgen, wijzigt medium de volgende dag met CM en ROCK inhibitor. Voeg het juiste antibiotische selectie na 24 - 48 uur.
4. Representatieve resultaten:
Discussion
Onze protocollen resulteren in eenvoudige, robuuste en zeer reproduceerbare technieken om transgenen te introduceren in de menselijke iPSCs zonder prominente toxisch effect en celdood. Human iPSCs worden gepasseerd in kleinere massa's van cellen (5-10 cellen) en uitgeplaat op Geltrex met hoge dichtheid (1:2) tot optimale transfectie efficiëntie in vele kleine kolonies. Voor menselijke iPSC lijnen die meer vatbaar voor differentiatie en celdood moet hoger aantal menselijke iPSCs (maximaal 4 x 10 6 cellen) worden gebruikt voor een nucleofectie experiment. Transiënte transfectie test verschaft een groot aantal transgen-expressie menselijke iPSCs binnen 1 dag. Stabiel getransfecteerd IPSC klonen verschijnen meestal binnen 7 dagen, en deze transgene kolonies moet bereid zijn om geplukt te worden binnen drie weken. Het gebruik van CAG promotor hier beschreven zorgt overal uitdrukking van eGFP verslaggever. Onder dergelijke verbeteringen onze protocollen worden geïnjecteerd in andere toepassingen, zoals overexpressie, conditioneel inductie, afleiding van lineage-specifieke reporter lijnen, shRNA of siRNA knock-down, gene targeting en homologe recombinatie.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Werk beschreven in dit handschrift werd mogelijk gemaakt door financiële steun van het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) voor UCR Stem Cell Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Glass beads should be washed with hydrochloric acid (HCl) overnight, rinsed off with sodium hydroxide (NaOH) and distilled water, and sterilized by autoclave before use. |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0263 | |
| DMEM (high glucose) | Lonza Inc. | 12-741 F | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Geltrex | Invitrogen | 12760013 | Growth factor reduced |
| GeneJuice transfection reagent | EMD Millipore | 70967 | |
| Glutamax-I (100X) | Invitrogen | 35050061 | L-Glutamine (Invitrogen, 25030081) can also be used instead. |
| Human iPSC KOSR media | 500 ml human ES media consists of 390 ml KnockOut DMEM/ F12, 100 ml KnockOut Serum Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. | ||
| KnockOut DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | |
| KnockOut Serum Replacement (KOSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| Mouse embryonic fibroblast media | MEF media consists of 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I and 1X sodium pyruvate in DMEM (high glucose) | ||
| Non essential amino acid, NEAA?(100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| Human stem cell nucleofector solution 1 with supplement | Lonza Inc. | VAPH-5012 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Invitrogen | 10010023 | |
| Sodium pyruvate (100X) | Invitrogen | 11360070 | |
| STEMPRO medium kit | Invitrogen | A1000701 | 500 ml STEMPRO media consists of 454 ml KnockOut DMEM/ F12, 10 ml STEMPRO serum-free growth supplement (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml BSA (Bovine serum albumin, 25%), 909 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. |
References
- Liew, C. G. Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation. Ann Med. 37, 521-532 (2005).
- Eiges, R. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homogous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).
- Siemen, H. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
- Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives. Stem Cells. 26, 525-533 (2008).
- Braam, S. R. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).
- Braam, S. R. Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification. Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).
- Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).
- Placantonakis, D. G. BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage. Stem Cells. 27, 521-532 (2009).
