Summary
Den dendritiska arborization sensoriska neuroner i
Abstract
Nervsystemets utveckling kräver rätt specifikation av neuron position och identitet, följt av noggrann neuron klass-specifika dendritiska utveckling och axonal ledningar. Nyligen dendritiska arborization (DA) sensoriska nervceller i Drosophila larver perifera nervsystemet (PNS) har blivit kraftfulla genetiska modeller där för att belysa både allmänna och klass-specifika mekanismer av neuron differentiering. Det finns fyra huvudsakliga DA neuron klasser (I-IV) 1. De är namngivna i syfte att öka Dendrite berså komplexitet, och ha klass-specifika skillnader i den genetiska kontroll över sin differentiering 2-10. DA sensoriska systemet är en praktisk modell för att undersöka de molekylära mekanismerna bakom kontroll av dendritiska morfologi 11-13 eftersom: 1) det kan ta nytta av de kraftfulla genetiska verktyg som finns i bananfluga, 2) DA neuron Dendrite berså breder ut på bara två dimensioner under ett optiskt clear larver nagelbanden gör det enkelt att visualisera med hög upplösning in vivo, 3) den klass-specifika mångfald i dendritiska morfologi underlättar en jämförande analys för att finna nyckelfaktorer som styr bildandet av enkla kontra mycket förgrenade dendritiska träd, och 4) dendritiska berså stereotypa former av olika DA neuron underlätta morfometriska statistiska analyser.
DA neuron aktivitet ändrar produktionen av en larver förflyttning centrala mönstergeneratorer 14-16. De olika DA neuron klasser har olika sensoriska modaliteter, och deras aktivering framkallar olika beteendemässiga 14,16-20. Dessutom olika klasser skickar axonal prognoser stereotypt i Drosophila larver centrala nervsystemet i ventrala nerv sladd (VNC) 21. Dessa prognoser avsluta med topografisk representationer av både DA neuron sensorisk modalitet och positionen i kroppen väggen i dendritiska fältet 7,22, 23. Därför undersökning av DA axonal beräkningar kan användas för att belysa mekanismerna bakom topografisk kartläggning 7,22,23 samt ledningar av en enkel krets modulerande larver förflyttning 14-17.
Vi presenterar här en praktisk guide för att generera och analysera genetiska mosaiker 24-märkning DA neuron via MARCM (Mosaik analys med en Repressible cell markör) 1,10,25 och FLP ut 22,26,27 tekniker (sammanfattas i Figur 1.).
Protocol
1.Preparation av reagenser
- Förbered Ca + +-free HL3.1 koksaltlösning 28.
- I mm: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 sackaros och 5 trehalos, pH 7,2. Filtrera sterilisera och lagra vid 4 ° C.
Obs: Ca + +-free-lösning förhindrar muskelsammandragningar under dissekering.
- I mm: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 sackaros och 5 trehalos, pH 7,2. Filtrera sterilisera och lagra vid 4 ° C.
- Gör poly-L-lysin (PLL) täckglas.
- Lös upp 100 mg PLL i 4.2ml vatten och 300μl alikvoter i Eppendorf-rör och frys vid -20 ° C.
- Innan beläggning täckglas, först tina en alikvot, ta den upp till 10ml i DDH 2 O och lägga 20μl av Kodak Photo-Flo, den slutliga PLL koncentrationen är 0,7 mg / ml.
- Sänk täckglas för 30 minuter i PLL-lösning, ta bort och torka och skölj sedan snabbt med vatten och torka. Upprepa två gånger. Behandlade täckglas pågå i ungefär en månad.
2. Genetiska korsar
- To generera MARCM kloner. Här är ett exempel kors med en pan-DA förare 11,27:
FRT2A x hsFLP, Gal4 109 (2) 80, UAS-mCD8:: GFP; TUB-Gal80 FRT2A/SM5-TM6B - För att generera FLP ut kloner. Här är ett exempel kors med en klass IV-specifik drivrutin 8:
PPK-Gal4 x YW, hsFLP, UAS-FRT-CD2, y +-stop-FRT-mCD8:: GFP
3. Insamling av embryon
- Håll Drosophila kors i en samling flaska vid 25 ° C och samla embryon på en äppeljuice agarplatta 29 spridas med ett tunt lager av jäst pasta 30,31.
4. Värme chockbehandling av embryon
- Placera en tom tallrik i opposition till äppeljuice agarplatta på vilka embryon har lagts. Täta runt dessa två plattor med Parafilm (Fig. 2).
- Under heat shock, sänk the plattan i vattenbadet och håll den med en metall vikt.
- För MARCM embryon
- Samla embryon för 2h och inkubera i en 10cm petriskål omgiven av fuktad vävnader vid 25 ° C i ytterligare 2 timmar.
Obs: Justera protokollet värmechock förändrar hur ofta kloner genereras. - För ett mindre antal kloner, siktar på enskilda isolerade nervceller, dyka och värme chock i vattenbad 1 timme vid 38 ° C.
- För ett större antal kloner, värme chock i 45 minuter vid 38 ° C, återhämta sig vid RT 30 minuter, därefter heat shock igen för ytterligare 30 minuter.
- Samla embryon för 2h och inkubera i en 10cm petriskål omgiven av fuktad vävnader vid 25 ° C i ytterligare 2 timmar.
- Samla FLP ut embryon för 24h, och värme chock för 1h vid 38 ° C.
5. Screening för kloner
- Efter heat shock, ta bort locket på vattentäta system och placera äpplet plattan juice agar i en 10cm petriskål omgiven av fuktad vävnader. Kultur embryon och efterföljande larver vid 25 ° C tills vandraning 3: e INSTAR.
Obs: odlingsbetingelser, speciellt nutrition har visats påverka DA dendritiska bersån morfologi 32,33. Se till att växande larver har tillgång till jäst klistra in hela tiden, övervaka och fylla jästen klistra in efter behov. - Från denna punkt i protokollet och framåt, manipulera larver försiktigt med hjälp av insekter pincett.
- Kortvarigt och försiktigt skölja larverna i kranvatten och sedan placera på en agarplatta.
OBS: Detta steg minskar bakgrundsljud automatiskt fluorescens från mat eller smuts på larver ytan. - Undersök larver under en kraftfull fluorescens dissekera mikroskop. Identifiera larver med GFP-positiva nervceller / celler i kroppen väggen.
6. In vivo avbildning av dendriter
- Placera larven in i en depression bild glas med en liten droppe 80% glycerol. Sätt på ett täckglas på bild för att immobilisera larven. Se till att ingen luft kvar mellan larv och coverslis.
- Tryck försiktigt in täckglas att rulla larven för att möjliggöra visualisering av neuron av intresse. Bild på mCD8:: GFP-märkta dendritiska berså via konfokalmikroskopi.
7. Larver dissektion
Observera innan du börjar: DA neuron dendriter snabb nedbrytning efter initiering av dissekering. Dissekera varje larv på mindre än 5min för att garantera god Dendrite morfologi.
- Dissekera vandrande 3: e INSTAR larver på en Sylgard plattan enligt beskrivningen tidigare 34 med följande ändringar:
- För avbildning av DA neuron Axon Termini, se till att CNS är intakt och segmentell nerverna bryts inte. Efter öppnandet larverna, först försiktigt skära trakeal anslutningar till kroppen väggen och sedan försiktigt ta bort hela tarmen.
- Om avbildning av dendriter ensam, ta bort CNS att tillåta en plattare montering.
8. Fixatjon och blockering av larver filéer
- Med larven fortfarande fästs på Sylgard plattan, sätt fast den i 4% PFA i PBS för 20mins vid RT på ett mjukt rotera shaker.
- Ta bort spår av larver vävnader (fett kroppen, luftstrupe, etc.) efter upptagningen.
- Tvätta i PBST (PBS med 0,1% Triton X-100) 3x 10mins på Sylgard plattan och shaker. Om undersöka Axon Termini, hålla filén på Sylgard plattan. (Om färgning dendriter det är möjligt att överföra larver filéerna i en 0,5 ml tub i detta steg 34)
- Blockera larverna för 20mins vid RT i 5% normala åsna serum (NDS) i PBST på en shaker.
9. Färgning av larver filéer
- Avlägsna den blockerande lösningen och inkubera vid primär antikropp (i 5% NDS / PBST) över natten vid 4 ° C i en liten Tupperware behållare omgiven av fuktad vävnader.
- Ta bort rören från 4 ° C och inkubera ytterligare en timme vid RT.
- Tvätta 6x 10mins i PBST. Lägg till den sekundära antibODY (i 5% NDS / PBST) och lock för att förhindra fluoroforen foto-blekning 34.
- Inkubera antingen på RT för två timmar, eller över natten vid 4 ° C följt av en timme vid RT.
- Tvätta larver 6x 10mins i PBST och gå vidare till montering.
10. Montering av larver filéer för granskning av Dendrite berså
- Montera varje larver filé så platt som möjligt med hjälp av dissekera sax eller en skalpell för att skära av huvudet (inklusive munnen krokar), och den bakre (inklusive spiracles) 34.
- Placera larver filén på bilden nagelbanden och ner, montera i 80% glycerol och täta sidor täckglas med nagellack för en "snabb" mount 34.
- För permanent montering och en tydligare bild
- Placera dissekerade larver filén muskler och ner på en droppe PBS på en PLL täckglas, kommer det att hålla sig snabbt till täckglas.
- Ta bort så mycket vätska som möjligt efter montering, however inte tillåter den att helt torr.
- Ta täckglas (med bifogad larver filé) genom en etanol-serien: 35% etanol, följt av 50%, 70%, 95%, och slutligen 2x 100% etanol vardera för 10 minuter (om den 2: a 100% EtOH lösning bytas ofta ), slutligen, tvätta 2-3x 10mins i xylen.
- Sätt en droppe DPX monteringsvätska (Distyrene Mjukgörare xylen) på en ren bild och försiktigt lägga täckglas filén och ner ovanpå. Håll i mörkret och vänta en dag för DPX att ställa innan avbildning.
11. Montering av larver filéer för undersökning av axonet ändstationer
- Håll segmentella nerver som går mellan PNS och CNS intakt under dissektion, fixering och färgning för att möjliggöra spårning av axoner från perifera sensoriska neuron cellkroppen till VNC.
- Montera varje larver filé nagelband och ner i 80% glycerol i en depression bild. Spåra axoner från DA cellkroppen tillVNC under konfokalmikroskop. OBS: PNS nervceller i varje organ väggsegment projektet till besläktat segment av VNC.
12. Representativa resultat:
Representativa resultat visas i figur 3-5. Fig. 3 visar hela berså i en klass IV da neuron, fångas in vivo under konfokalmikroskop. Fig. 4 visar en närbild av en del av Dendrite berså av en immunhistokemiskt märkt klass III neuron som har rätt fast att bevara morfologi. Det tillhörande infällda bilden visar nedbrytningen som kan uppstå efter ett misslyckat dissektion och fixering (båda färgats med anti-GFP antikropp). Fig. 5 visar en enda klass IV axonet ändstationen i CNS (anti-GFP, grönt), alla klass IV Termini är co-färgade med anti-CD2 (magenta).
Figur 1 Protokoll översikt. a) Samla in och sedan värme-chock embryon. b) Välj en larv med GFP-positiva DA neuron klon, och sedan bilden GFP-märkta Dendrite bersån i live larven. c) dissekera larv och sedan immunhistokemiskt fläcken filén. d) Montera det färgade filén och sedan bilden av dendritiska bersån och axonal prognoser av DA neuron kloner.
Figur 2 Beredning av äppeljuice agarplatta för värme chock. Ta plattan (vit pil, AB), lägga till en andra petriskål ovanpå (röd pil b) och tätning runt med Parafilm (blå pil, b).
Figur 3 in vivo bild av Dendrite berså av en mCD8:: GFP-märkta MARCM klon (genotyp som i 2,1) vilket motsvarar en klass IV (v'ada) neuron i en 3: e INSTAR larv. Skala bar är 50μm.
d/3111/3111fig4.jpg "/>
Figur 4 mCD8:: GFP-märkta MARCM klon av ett klass III neuron (ddaA) färgad med anti-GFP-antikropp, som visar goda morfologi efter framgångsrik dissektion och fixering (grön). Den infällda bilden visar Dendrite nedbrytning (vita pilar) som inträffade efter misslyckade dissektion och fixering (magenta). Skala bar är 25μm.
Figur 5 Den 3: e INSTAR larver VNC. En FLP ut klon av en enda klass VI (VDAB) axonet Terminus (genotyp som i 2,2) upptäcks med hjälp av anti-GFP antikropp (grön). Anti-CD2 etiketter alla klass IV Termini (magenta). Skala bar är 25μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Drosophila larver DA neuron modellen ger en utmärkt genetiska system för att undersöka mekanismer som styr neuron morfologi och krets bildas. MARCM används vanligen för märkning och för att generera muterade DA neuron kloner. För MARCM använder vi antingen en pan-neural (t.ex. Gal4 C 155) eller DA neuron-specifik drivrutin. Med hjälp av en pan-neurala förare är det möjligt att direkt använda flera lager allmänt tillgänglig från offentliga lager centra. Men med hjälp av en DA-neuron drivrutin kan vara en fördel eftersom märkt kloner inte kommer att genereras i CNS, och sådana kloner kan komplicera analysen av DA axonal Termini. En lista över vanliga DA-specifika Gal4 linjer kan hittas i Shimono et al (2009) 27. FLP-out kan vara särskilt användbart när utredare vill samtidigt ectopically uttrycka en gen med hjälp av Gal4-UAS binära systemet 35 och mäta morfologi i en märkt enda neuron. Dessutom avbildningprotokoll som presenteras här kan användas när DA nervceller är märkta med Gal4-UAS-system 35 ensam.
Om ett bra fluorescerande dissekera mikroskop är tillgänglig är det möjligt att välja larv bär kloner med på en normal fluorescerande mikroskop och ett mål med en lång arbetsdag avstånd. Under live-avbildning av Dendrite bersån (avsnitt 6) vi immobilisera larven enbart genom nedåtriktad kraft som utövas av täckglas. I anpassning av detta protokoll för annan användning utredare kan även immobilisera larver genom narkos 36,37.
Under immunohistological färgning använder vi generellt anti-GFP eller anti-CD8 till märkning av neuron. I FLP-experiment anti-CD2 kan dessutom markera alla nervceller där Gal4 föraren linje som används är aktiv (bild 5). När man granskar DA axonet terminaler i VNC, kan anti-Fasciclin2 antikropp märkning skall användas till att belysa landmärke axonet traktater 7,22,38.
32. Dessutom kommer DA neuron dendriter, särskilt i klass III och klass IV, snabb nedbrytning efter början av dissekering. Vi föreslår att dela upp och fastställande larv individuellt. Fixering bör ske inom 5mins initiera dissekering för att säkerställa bra underhåll av Dendrite morfologi. Slutligen kommer montering larver så platt som möjligt till stor hjälp senare morfometriska analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna tackar RIKEN för finansiering. Vi tackar också Cagri Yalgin, Caroline Delandre, och Jay Parrish för diskussioner om genetiska och immunohistokemi protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZX16 fluorescence dissection microscope (with GFPHQ filter) | Olympus Corporation | SZX16 | |
| Live Insect Forceps | Fine Science Tools | 26030-10 | |
| 26mm x 76mm depression slide glass | Toshinriko Co. | T8-R004 | |
| Sylgard 184 (or Silpot 184) | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1524 | This product has proven most effective |
| DPX mounting medium | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Rabbit anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-CD8 | Caltag | 5H10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-CD2 | AbD Serotec | MCA443R | Dilution 1:700 |
| Mouse anti-Fasciclin2 | DSHB | 1D4 | Dilution 1:10 |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315, 232-242 (2008).
- Hattori, Y., Sugimura, K., Uemura, T. Selective expression of Knot/Collier, a transcriptional regulator of the EBF/Olf-1 family, endows the Drosophila sensory system with neuronal class-specific elaborated dendritic patterns. Genes Cells. 12, 1011-1022 (2007).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43, 809-822 (2004).
- Li, W., Wang, F., Menut, L., Gao, F. B. BTB/POZ-zinc finger protein abrupt suppresses dendritic branching in a neuronal subtype-specific and dosage-dependent. 43, 823-834 (2004).
- Zlatic, M., Landgraf, M., Bate, M. Genetic specification of axonal arbors: atonal regulates robo3 to position terminal branches in the Drosophila nervous system. Neuron. 37, 41-51 (2003).
- Grueber, W. B., Ye, B., Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Dendrites of distinct classes of Drosophila sensory neurons show different capacities for homotypic repulsion. Curr Biol. 13, 618-626 (2003).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112, 805-818 (2003).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Moore, A. W. Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology. Cell Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol. Cell. Neurosci. 35, 383-396 (2007).
- Nishimura, Y. Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model. J Neurogenet. 24, 194-206 (2010).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 5199-5204 (2007).
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19, 799-806 (2009).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (1), e85-e85 (2006).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Merritt, D. J., Whitington, P. M. Central projections of sensory neurons in the Drosophila embryo correlate with sensory modality, soma position, and proneural gene function. J Neurosci. 15, 1755-1767 (1995).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Wong, A. M., Wang, J. W., Axel, R. Spatial representation of the glomerular map in the Drosophila protocerebrum. Cell. 109, 229-241 (2002).
- Shimono, K. Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death. Neural Dev. 4, 37-37 (2009).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Kaczynski, T. J., Gunawardena, S. Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (46), e2150-e2150 (2010).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. J Vis Exp. , (2009).
- Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster. Genetics. 172, 2325-2335 (2006).
- Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress. J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sugimura, K. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
- Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites. Dev Biol. 260, 207-225 (2003).
