Akut och kronisk Taktil Sensorisk Provning efter ryggmärgsskada hos råttor

Summary

Vi beskriver två taktila sensoriska testmetoder för akuta eller kroniska perioder av ryggmärgsskada hos råttor. Dessa validerade procedurer kan upptäcka utveckling och underhåll av allodyni-liknande känsla.

Abstract

Ryggmärgsskada (SCI) försämrar sensoriska system som orsakar allodyni ^1-8. För att identifiera cellulära och molekylära orsaker till allodyni, känsliga och gäller sensoriska test i råtta SCI modeller behövs. Men fram till nyligen hade ingen enhetlig testningsförfarande har validerats för SCI, så att standardiserade metoder inte har genomförts i hela Labs. Dessutom kan tillgängliga testmetoder inte genomföras akut eller när svår Rörelsehinder funnits, förebygga studier av utvecklingen av SCI-inducerad allodyni ^3. Här presenterar vi två validerade sensoriska testmetoder med von Frey hår (VFH) monofilament som kvantifierar förändringar i taktila sensoriska trösklar efter SCI ^4-5. Ett test är väl etablerade Up-Down test som visar hög sensitivitet och specificitet mellan olika SCI svårighetsgrader vid test kroniskt ^5. Den andra testet är ett nyutvecklat dorsal VFH test som kan användas akut efter SCI närllodynia utvecklar, innan motorn återvinning ^4-5. Varje VFH monofilament gäller en kalibrerad kraft vid beröring med huden på baktassen tills den böjs. I upp-ner-metoden, är alternerande VFHs av högre eller lägre krafter används på plantar L5 dermatom att avgränsa flexor återtagströsklarna. Successivt högre krafter vidtas fram till dess uttag sker då lägre kraft VFHs används tills tillbakadragande upphör. Den kännbara tröskeln reflekterar den kraft som krävs för att framkalla abstinens hos 50% av de stimuli. För den nya testet är varje VFH appliceras på rygg L5 dermatom i tassen, medan råttan stöds av examinator. Den VFH stimulering sker i stigande ordning kraft förrän minst 2 av 3-program vid en viss kraft ger tassen tillbakadragande. Taktil sensorisk tröskel är den lägsta kraft för att framkalla tillbakadragande 66% av tiden. Acklimatisering, provning och scoring procedurer beskrivs. Avvikande studier som kräver ett omtest och typiska försök definieras. Djuranvändning wsom har godkänts av Ohio State University Animal Care and Use Committee.

Protocol

1. Upp / Ner Plantar Von Frey Testing

Syftet med testet är att bestämma taktil känslighet genom att mäta hur mycket kraft som erfordras för att framkalla tassbortdragande från stimulus. Kommersiellt tillgängliga kalibrerade Von Frey Hår monofilament mellan intervallen 4,56 och 6,10 används för att stimulera tassen. Andra sinnesintryck som visualisering av stimulans eller proprioception kan förbrylla taktila tröskel åtgärder för svar baserade på visuella eller proprioceptiva ingång är ogiltiga. För att förhindra visualisering av monofilament vidrör huden, testar vi bara när råttan äter spannmål. Denna kognitiva distracter även ser till att alla råttor testas på liknande grundläggande nivåer av komfort. För att undvika svar på grund av proprioceptiva snarare än taktil input, inte inkluderar vi inte prövningar där monofilament lyfter eller flyttar tassen.

A. acklimatiseringen FÖRFARANDEN FÖR UPP-down-strategi

1. Föreliggande frukt CereaL i hemmet buren så råttorna igen och söka maten belöning. Råttor behöver inte vara mat berövade vid någon punkt i gentling eller testprocessen.
2. Råttor är redo att acklimatisera sig till testmiljön-och när de äter frukt spannmål i hemmet buren. Acklimatisering sker över minst 4 möten 10 minuter vardera men fler kan behövas. Tio minuters sessioner används så att råttorna inte blir mätta före slutet av sessionen.
3. Placera råttan i testet kammaren med tre bitar av frukt spannmål. Ge ytterligare frukt spannmål 1-2 åt gången som de ätit. På den tredje perioden, medan råttan äter, producerar handrörelser under viran golvet så att råttan blir van vid rörelse under dess tassen. På den fjärde sessionen tillämpa 5,18 monofilamentet till fotsulan av tassen ungefär en gång per minut för en totalt tio presentationer. En naiv råtta bör inte svara på denna sub tröskeln stimulans.
4. Tally bitar av spannmål konsumeras ofta urinering och defekation, frysning, och grooming beteenden. Frysning inträffar på två sätt: a) råttan hukade låg på marken oftast i närheten av bakre väggen eller vänd bort från examinator och förblir orörlig, b) råttan böjd över i mitten av buren och oftast snackar sina tänder . Frysning beteenden kan fortsätta under lång tid.
5. En gentled råtta som är redo för testning kommer att äta nästan oavbrutet i 10 minuter. Det kommer att röra sig lätt i buren och söka frukt spannmål mycket snabbt efter att ha förtärt den sista. Viktigt att råttan inte sluta äta eller distraheras av handrörelser under tråden golvet eller monofilament ansökan till tassen.

B. testförfaranden för upp-ned-STRATEGI

1. Råttor producerar nöd läten som ligger över vår mänskliga fonetiska sortiment. Råttor som väntar på att testas bör hållas i ett separat rum så att de inte kan höra dem VOCalizations.
2. Råttor med ryggmärgsskada som är lämpliga för upp-ned von Frey hår testning måste visa viktbärande med armar och ben. Lemmar som inte kan stödja råttan inte tillförlitligt kan testas eftersom tillämpningen av monofilament flyttar tassen innan håret böjs.
3. Placera en råtta i testet kammaren med 2 eller 3 bitar av frukt spannmål. Råttor ska äta under varje VFH program.
4. Rulla en tärning för att avgöra vilka HL att börja testa först. Jämna tal representerar den högra tassen och udda nummer representerar vänster.
5. Börja testet session med 5,18 monofilament. Utsättningssymtom kan inträffa från 4,56 till 6,10 i normala och SCI råttor och 5,18 monofilament faller i mitten av intervallet.
6. Applicera inte en monofilament medan en råtta fryser, hukar eller inte äta. Om testaren väntar, ibland dessa villkor kommer att lösa och testning kan återupptas. Om råttan visar dessa beteenden och den totala tiden i AppAratos är 20 minuter, stoppa testning och testa igen från början nästa dag. Ta inte bort råttan medan det visar dessa beteenden eftersom detta kan öka deras förekomst. Vänta tills råttan bryter ut av dessa mönster innan du hanterar den för att undvika att förstärka dessa beteenden.
7. Tryck på monofilament till L5 plantar dermatom av baktassen mellan trampdynorna tills böjer (se figur 1a). Denna jämna stadiga ansökan bör ta ungefär en sekund sedan bort den från huden. Undvik att vidröra någon del av trampdynorna som känslighet i huden är mycket lägre i dessa områden. Denna enda kontakt utgör en rättegång.
8. Ett positivt svar inträffar när råttan snabbt lyfter tassen upp bort från monofilament. Tillbakadragandet måste initieras med den tid monofilamentet tas bort för att bekräfta att svaret är associerad med monofilament ansökan.
9. Titta på djur i andra tecken på medvetenhet om Monofilament kontakt som vokalisering, ser nedåt, bakåt eller i den testade tassen, slickar tassen, ihållande tass tillbakadragande eller ryckningar öronen. Notera dem på databladet. När dessa beteenden sker med tassen tillbakadragande det fungerar som bevis på supraspinal uppfattning av stimulus.
10. Om det finns en positiv respons, applicera den näst lägsta monofilament. Om inget svar (negativt), flytta upp till nästa högre monofilament. Tillåt 30 sekunder mellan varje monofilament ansökan om de sensoriska receptorerna att komma tillbaka till utgångsläget bränning före förnyad undersökning (för att förhindra anpassning).
11. Fortsätta att tillämpa högre eller lägre monofilament på baktassen baserat på positiva eller negativa svar tills du har 10 försök. Upprepa sedan på den andra baktassen. (Se exempel datablad).
12. Den högsta VFH som kan testas utan att införa proprioceptiva ingång och lyfta tassen är 6,10. Den 6.45VFH och större bör inte användas eftersom tassen lyfter innan monofilament krökar. Om det inte finns något svar på 6,10 då nästa försök kommer att tillämpa 6,10 igen.
13. Ett svar ska annulleras och rättegången måste testas på nytt om en av följande inträffar under den stimulans ansökan eller paw uttag:
    1. Råttan inte kontinuerligt äter.
    2. Råtta rör sig bort från VFH stimulus före böjningen av monofilament, vilket gör det omöjligt att veta den kraft som appliceras som framkallar den tillbakadragande respons.
    3. Tassen lyfts av VFH (antingen före eller efter VFH är böjd) åstadkommande proprioceptiva förutom taktil stimulering.
14. En test session vanligtvis kan fyllas i mindre än 15 minuter för båda bakbenen.

C. databehandling för UP-down-metod

1. En lyckad test kommer att ha 10 sekventiella försök för varje tass.
2. Värdet av den taktila tröskeln är det lägsta monofilament som ger tassen uttag på & ge, 50% av presentationerna och 3 eller flera presentationer av monofilamentet har ges (se exempel datablad har gränsvärden inringad).
3. En monofilament med endast 2 totalt prövningar inte är vald som tröskeln även när en rättegång är positiv och en är negativ. Flera presentationer av stimulans är bättre indikatorer på mönstret av svaren till denna styrka.
4. Om det inte monofilament som ger positiva reaktioner på minst 50% av testerna är råttan får en poäng på 6,45. Detta innebär att råttan inte detektera den högsta testbar monofilament av 6,10 bortom slumpen. Ett värde på 6,45 ges eftersom den representerar nästa värde högre än testbara olika monofilament.
5. Konvertera tröskelvärdet för höger och vänster tassar i gram kraft. De gram kraftvärden kommer att tillhandahållas av leverantören av von Frey hår. . För data från bilaterala skador, kan tröskeln gram kraft för de två tassar som medelvärdet samman för att geen enda poäng.

2. Dorsala von Frey-testning

Syftet med denna provning är att bestämma taktil känslighet i råttor med så dåligt motorstyrning att de inte kan testas med hjälp av typiska plantar VFH metoder. Det kvantifierar hur mycket kontakt kraft behövs för att producera en obehaglig svar. För att undvika svar proprioceptiva stimuli, inte inkluderar vi inte prövningar där tassen förflyttas av VFH under applicering. Dessutom inkluderar vi inte försök i vilka VFH glider eller borstas tvärs den dorsala ytan av foten.

A. acklimatiseringen FÖR DORSAL von Frey-testning

1. Gentle råttor för fyra sessioner på 10 minuter före baslinjen testning och ryggmärgsskada.
2. Löst svepa råttan i en liten handduk så att bakdelen utsätts enligt nedan (Figur 1B). Placera råttan över ett bord med baktassarna lätt vilar på ytan. Använd sammaSnug men inte för hårt wrap och håll för varje råtta. Stagning din underarm på kanten av bordet kan minska variabilitet mellan råttor.
3. En gentled råtta som är redo för testning kommer inte motstå hålls in handduken under flera minuter i följd, men du kan behöva på nytt linda råtta 1 eller 2 gånger under testning av båda baktassarna.

B. testförfaranden för DORSAL von Frey-testning

1. Rulla en tärning för att avgöra vilka bakben för att börja testa först. Jämna tal representerar den högra tassen och udda nummer representerar vänster.
2. Löst linda råttan in handduken lämnar exponerade bakdelen.
3. Taktil stimulans tillämpas först efter det att råttan är lugnt och tyst i minst 10 sekunder.
4. Från och med 4,56 VFH, tillämpa monofilamentet vinkelrätt mot den dorsala ytan mellan första och andra metatarsal ca 1 cm proximalt om leden (figur 1C). Tillämpas monofilamentet i en jämn, steAdy sätt över en sekunds intervall tills den böjer sedan bort den. Denna enda kontakt utgör en rättegång.
5. En positiv respons uppstår när råttan snabbt flyttar tassen bort från stimulus. Rörelseriktningen är ofta bakre eller yttre innan bakbenet böjs. Tillbakadragandet måste initieras med den tid monofilamentet tas bort för att bekräfta att svaret är associerad med monofilament ansökan.
6. Applicera 4,56 monofilament två gånger med minst 30 sekunder mellan program i syfte att förhindra sensorisk "windup" och att låta de sensoriska receptorerna att komma tillbaka till utgångsläget bränning före förnyad undersökning (för att förhindra anpassning).
7. En stimulans bör testet på nytt om VFH slirar och försiktigt snuddar huden, vilket gör kraften levereras mer av en borsta eller sopa snarare än en spetsig kontakt.
8. Om det finns färre än 2 (dvs. 1 eller 0) positiva svar på 4,56 monofilamentgarn, är nästa större VFH tillämpas 3gånger på samma sätt.
9. På detta sätt är progressivt större VFHs från 4,56 till 5,88 tillämpas fram till två eller flera positiva svar inträffar eller tills största VFH nås.
10. Tassen återtagströskel är den lägsta VFH som framkallar minst 2 positiva svar av 3 försök.
11. Upprepa på andra tassen.
12. En test session vanligtvis kan fyllas i 15 minuter för båda baktassarna.

3. Representativa resultat

En lyckad test kommer att resultera i omedelbara, livlig tillbakadragande av baktassen för att ett vinkelrätt tillämpas VFH till mitten-plantar regionen (Figur 1A) eller dorsala ytan mellan den ¹ och ^{2: a} metatarsala 1 cm från leden (figur 1C) . Dessa svar är stämde att härleda taktil tröskelvärdet för varje baktass. Taktila trösklarna från rygg VFH tester i akut SCI visade utmärkt exakthet med plantar VFH trösklar draD vid kroniska ibland (Figur 2). Nedgångar i taktila trösklarna härrör från plantar eller rygg tester uppstå för graderad SCI (Figur 3 ^3,5). Denna överkänslighet yttrar så tidigt som 7 dagar efter SCI och upprätthålls under hela experimentet ^3-4,6. Medan en rad SCI svårighetsgrader inte påverkar taktil sensoriska tröskelvärdena i tassen, nedgång i trösklarna ske för svårare SCI (Figur 3). Viktigt är utvecklingen av under-nivå allodyni en allt eller inget svar som uppstår när det är en förlust av mer än 60% av den vita substansen i lesionen epicentrum. (Figur 4 ^3).

Taktila trösklarna kan sönderfalla och producera konstgjorda svar till låga VFH krafter. Minst två villkor kan producera tröskeln sönderfall - snabbt tillämpa VFH på huden i en peta-eller viftade sätt eller inte väntar tillräckligt länge mellan stimulans program. För att vara säkra på attde taktila trösklarna är äkta, måste man tillämpa varje VFH med en liknande låg hastighet strategi och interstimulus intervallet måste vara minst 30 sekunder. Vi har också visat att ätbeteende sänker tröskeln förfall ^5.

Figur 1. Schematisk och fotografiet visar placeringen av VFH stimulering för den plantara och dorsala von Frey-håret (VFH) testning. A) För plantar VFH testning bör von Frey-hår appliceras vinkelrätt mot mitten plantara baktass ca 1 cm bakom den mellersta falangen (såsom indikeras av den röda rutan i diagrammet av den plantara ytan av baktassen) vid en långsam konstant varvtal tills den böjs. B och C) För den dorsala VFH teknik, är råttan löst lindad i en kirurgisk duk som visas i fotografiet. Den VFH appliceras på dorsala ytan av tassen mellan den första och den andra metatarsalen approximately 1 cm proximalt till den gemensamma.

Figur 2. Mjukstrålar von Frey hår sensoriska trösklar korrelerar till standard plantar VFH. (N-44; Pearson Koefficient = 0,503, p <0,01, r2 = 0,67). Streckade linjerna visar tröskelvärdet för allodynisk känsla med användning av antingen den dorsala VFH eller plantar tekniker VFH och indikerar att allodynisk tröskelvärden vid 7 dagar efter SCI som använder Dorsal VFH testet förutsäga kronisk nedan nivå allodyni bestämdes genom plantar VFH metoder.

Figur 3. Tidiga rygg von Frey hår sensoriska trösklar förutse allodynisk och icke-allodynisk taktil känslighet över skador svårighetsgrader vid senare tidpunkter. Jämförbara sensoriska trösklar inträffade mellan 7 dagar efter SCI Dorsal VFH och 28 dagar efter SCI plantar VFH åtgärder. Anmärkningsvärd likhet inträffade för en brett utbud av SCI, med betydande allodyni noterade i måttlig till svår SCI (p <0,05 1,1 mm förskjutning mot alla andra grupper).

Figur 4. Procent av råttor som erhöll laminektomi (ingen SCI) och SCI grupper som uppvisar baktass allodyni vid 6 veckor efter SCI. Allodyni sågs endast hos råttor med måttliga eller svåra Sci (OSU ESCID enhet 0,9, 1,1, 1,25, 1,3 mm sladd förskjutningar) medan råttor med mild SCI (0,3, 0,5, 0,7 mm ryggmärgen förskjutningar) uppvisade normala svar på taktil stimulering. Representativa koronala ryggmärgen sektioner färgade för myelin vid lesionen epicentrum för laminektomi (oskadade kontroll), (0,5 mm förskjutning) milda, är måttligt (1,1 mm förskjutning) och svår (1,3 mm förskjutning) ryggmärgen kontusioner med för att visa graden av axonal skona som är förknippade med denna överkänslighet. (Skalstreck = 0,5 mm).

k ">

Figur 5. Ett prov datablad för upp-ned von Frey hår testning. Håret värdet och resultatet (positivt eller negativt) registreras för varje försök. Indikationer på supraspinal medvetenhet om testet noteras. Vid slutet av testet är svaren på varje hårstrå värdet stämde. Den valda tröskelvärdet för exempeldata är inringade.

Discussion

De VFH testmetoder presenteras här representerar två tester paradigm som är känsliga och gäller för användning i råtta SCI modeller. Viktigt var dorsala VFH testet skapades för bedömning av återvinning av taktila känsla av baktassarna akut efter mitten bröstkorg SCI när råttorna inte kan stå på deras bakdelar. Detta test paradigm kan också användas när råttorna återfå förmågan att stödja sin vikt och för bakbenen efter cervikal SCI.

De två paradigmer visat här använda kalibrerad VFH att bestämma den kännbara tröskeln för varje baktass. Andra metoder bestämma frekvensen om utträde till antingen ett normalt oskadligt eller normalt skadliga stimulans. Vi har tidigare visat att små förbättringar i taktila tröskelvärden kan representera skillnaden mellan närvaron av kronisk neuropatisk smärta och vanlig taktila känsla. Därför använder experimentella testmetoder som härrör smärttröskeln kan fagrinden underlättar translation av potentiella terapeutiska ingrepp till kliniken.

Som med alla beteendevetenskaplig tester, är det nödvändigt att minimera antalet confounders i testmiljön som kan påverka resultatet av beteende testet ^9. Sålunda är det viktigt att varje testsession sker vid samma tid på dagen, på samma temperatur-och fuktighetsreglerad rum. Dessutom, eftersom råttorna kommunicerar högljutt i en ultraljud område, är det viktigt att råttor väntar på att testas förvaras i ett separat rum tills deras tester påbörjas. Langford et al ¹⁰ visade dramatiska bevis på att naiva djur upplever smärta efter bevittnat ett cagemate utsätts för skadlig stimulering. För att ytterligare eliminera variationer i taktil sensorisk testning använder vi sockrade flingor som kognitiv distraktor under plantar VFH testning. Därigenom stabilisera vi de reaktioner hos djuret. Tröskeln är mindre troligt att sönderfalla i helatesta när en distraktor ges än när man inte är ^5. Denna stabilisering beror sannolikt på att härdningen av hypervigilant och katastroftankar beteenden, två förebyggande stater där hotet av smärta aktiverar rädsla och känslomässiga centra i hjärnan.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Semmes-Weinstein Monofilaments	Stoelting Co.	58011
Fish Breeder Box	Any Supplier		Hole drilled in side for cereal delivery
Elevated wire mesh (1/4" X 1/4" grid)	Hardware Store
Elastic to hold fish breeder box in place	Any Supplier
Sugared Cereal	Grocery Store
Surgical Huck Towel 16"x 23"	Medical Supply Store