Sıçanlarda Spinal Kord Yaralanma sonrası Akut ve Kronik Dokunsal Duyu Testi

Summary

Biz ratlarda spinal kord yaralanmasının akut veya kronik dönemlerde iki dokunma duyusal test yöntemleri açıklanmaktadır. Bu onaylanmış prosedürler allodini gibi duyumların geliştirme ve bakım algılayabilir.

Abstract

Spinal kord yaralanması (SKY) allodini ^1-8 neden duyu sistemleri bozar. Duyarlı allodini hücresel ve moleküler nedenleri ve sıçan SKY modellerinde geçerli duyusal test belirlemek için gereklidir. Bu standart metotlar laboratuarlar arasında uygulamaya henüz böylece Ancak, yakın zamana kadar, tek bir test yaklaşımı SKY için valide edilmiştir. Ek olarak, mevcut test yöntemleri akut uygulanamamıştır veya ağır motor bozukluk mevcut olduğunda, SCI indüklenen allodynia ³ geliştirilmesi çalışmaları önlenmesi. Burada SKY ^4-5 sonra dokunsal duyu eşikleri değişiklikleri ölçmek von Frey Saç (VFH) monofilamentler kullanılarak iki valide duyusal test yöntemleri sunuyoruz. Bir testi kronik ⁵ test farklı SCI şiddeti arasında yüksek duyarlılık ve özgüllük gösteren köklü Yukarı-Aşağı testtir. Diğer test SKY sonra akut olarak uygulanabilir yeni geliştirilmiş dorsal VFH testi olduğundallodynia önce motor iyileşme ^4-5, geliştirir. Bükülecek kadar arka ayaklarında, cilde dokunduğunda Her VFH monofilament kalibre edilmiş bir kuvvet uygular. Yukarı-aşağı yönteminde, yüksek veya düşük güçlerin alternatif VFHs fleksör çekilmesi eşikleri belirginleştiren plantar L5 dermatomunda kullanılır. Çekme kuvveti daha düşük VFHs çekilmesi geçene kadar kullanılır sonra oluşana dek gittikçe daha yüksek güçler uygulanır. Dokunsal eşik uyaranların% 50 geri çekilme ortaya çıkarmak için gerekli kuvvet yansıtır. Sıçan uzman tarafından desteklenirken yeni bir test için, her VFH pençenin dorsal L5 dermatomunda uygulanır. VFH stimülasyon belirli bir kuvvet az 3 uygulamaların en az 2 pençe çekme üretir kadar yürürlükte artan sırasında oluşur. Dokunsal duyu eşik zaman çekilmesi% 66 ortaya çıkartılması için en düşük güç. Aklimasyon, test ve puanlama işlemleri açıklanmıştır. Bir tekrar ve tipik çalışma gerektiren anormal denemeler tanımlandığı gibidir. Hayvan kullanımı wgibi Ohio Devlet Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

Protocol

1. Yukarı / Aşağı Plantar Von Frey Test

Testin amacı, daha kuvveti uyaran gelen pençe çekme ortaya çıkartılması için gerekli olan kadar ölçerek dokunsal hassasiyeti belirlemektir. 4,56 ve 6,10 olan aralığı arasında ticari olarak mevcut kalibre Von Frey kılı monofilamentlerin pençe teşvik etmek için kullanılır. Görsel veya proprioseptif girişi dayalı yanıtlar geçersiz nedenle uyarıcı veya Propriosepsiyon görselleştirme gibi diğer duyusal girdi dokunsal eşik tedbirleri etkilemesi için. Rat tahıl yemek yaparken cilt dokunmadan monofilament görselleştirme önlemek için, biz sadece test edin. Bu bilişsel çeldiriciye, aynı zamanda tüm sıçanlar konfor Benzer temel düzeyde test edilmesini sağlar. Çok dokunsal girişi daha proprioseptif nedeniyle tepkileri önlemek için, monofilament kaldırır veya pençe hareket çalışmalar dahil değildir.

YUKARI-AŞAĞI YAKLAŞIM A. Klorofenoller PROSEDÜRLER

1. Mevcut meyve cereafareler yiyecek ödül tanımak ve aramak çok ev kafeste l. Sıçanlar gentling veya test sürecinde herhangi bir noktada yoksun gıda olması gerekmez.
2. Sıçanlar onlar evde kafes içinde meyve tahıl yemek bir kez test ortamı ve prosedürlere acclimated hazırdır. Aklimasyonu her ama daha gerekli olabilir 10 dakika en az 4 seans içinde oluşur. On dakikalık seanslar sıçan oturumun sonuna kadar tok olmazlar böylece kullanılır.
3. Meyve tahıl üç adet test odasında sıçan yerleştirin. Ek meyve tahıl yedikleri gibi bir zaman ise bir ile iki sağlayın. Rat yemek yaparken sıçan pençesini aşağıya hareket alışık olur böylece üçüncü oturumunda, tel zemin altında el hareketleri üretir. Dördüncü oturumunda, yaklaşık kez ayaklarında, plantar yüzeyi on sunum olmak üzere toplam bir dakika için 5.18 monofilament geçerlidir. Bir naif sıçan bu alt eşik uyaranlara cevap olmamalıdır.
4. Uzun boyluy tüketilen tahıl parçalarını, idrar ve dışkılama, don ve damat davranışların sıklığı. Donma davranış iki şekilde oluşur: a) sıçan arka duvarına yakın genellikle yere çömeldi düşük veya sınav dönük ve hareketsiz kalır b) sıçan kafesi ortasında eğilmiş ve genellikle diş gevezelik . Donma davranışlar uzun süre devam edebilir.
5. Test edilmeğe hazır hale A mutedil sıçan 10 dakika boyunca yaklaşık olarak sürekli yiyecek. Bu kafes içinde kolaylıkla hareket ederler ve son tükettikten sonra çok hızlı bir şekilde meyve tahıl arayacak. Önemlisi, sıçan yeme durmayacak ya da tel döşeme veya pençe için monofilament uygulama altında el hareketleri ile avunmak.

YUKARI-AŞAĞI YAKLAŞIM B. TEST İŞLEMLERİ

1. Sıçanlar insan işitsel aralık üzerindedir sıkıntı seslenişleri üretmek. Onlar bu voc duyamıyor böylece test için bekleyen Rats ayrı bir odada tutulmalıalizations.
2. Von Frey Saç testi yukarı-aşağı için uygun olan omurilik yaralanması olan sıçanlarda uzuvlarıyla birlikte ağırlık taşıyan göstermek zorundadır. Monofilament uygulama saç virajlı önce pençe taşır, çünkü sıçan destek veremiyoruz Limbs güvenilir bir şekilde test edilemez.
3. Meyve kabuğu 2 veya 3 adet test odasında sıçan yerleştirin. Sıçanlar her VFH uygulama esnasında yemek gerekir.
4. HL ilk test başlatmak belirlemek için bir kalıp döndürün. Hatta numaraları sağ pençe temsil ve tek sayılar sol temsil eder.
5. 5.18 monofilament ile test oturumu başlayın. Çekilme tepkiler normal ve SKY sıçanlarda 4.56 den 6.10 kadar oluşabilir ve 5.18 monofilament aralık ortasına düşer.
6. Bir sıçan, çömelir donuyor veya yemez ise bir monofilament uygulama yapmayınız. Tester bekler, bazen bu şartları çözeceğini ve testleri devam edebilirsiniz. Sıçan app bu davranışlar ve toplam süreyi görüntüleraratus başından ertesi gün test ve tekrar test durdurmak, 20 dakikadır. Bu gerçekleştikten artabilir olarak bu davranışlar sergileme iken sıçan çıkarmayın. Sıçan, bu davranışların takviye önlemek için dokunmadan önce, bu kalıpları kıran kadar bekleyin.
7. Eğilir (Şekil 1A bakınız) kadar ayak pedleri arasında arka ayaklarında, L5 plantar dermatom için monofilament dokunun. Bu pürüzsüz kararlı uygulama yaklaşık bir saniye sonra cilt çıkarın almalıdır. Cilt hassasiyeti bu alanlarda çok daha düşük olduğu gibi ayak pedleri herhangi bir bölümünü dokunmaktan kaçının. Bu tek dokunmatik bir deneme teşkil etmektedir.
8. Sıçan hızlı monofilament uzak pençe kaldırır zaman pozitif bir tepki oluşur. Geri çekilme yanıtı monofilament uygulama ile ilişkili olduğunu teyit etmek için monofilament kaldırılır zaman başlatılması gerekir.
9. Mo bilincinin diğer kanıtları da hayvan izlegibi seslendirme gibi nofilament dokunmatik, aşağı, geri veya test pençe bakarak pençe, sürekli pençe çekme yalama veya kulak seğirmesi. Bilgi formunda bunları unutmayın. Bu davranışları pençe çekme meydana zaman uyaranın supraspinal algı delil olarak hizmet vermektedir.
10. Bir pozitif tepki yoksa, bir sonraki düşük monofilaman uygulanır. Yanıt yok (negatif) varsa, bir sonraki daha yüksek monofilament kadar hareket ettirin. (Adaptasyon) engellemek için yeniden test öncesi bazal ateş geri gelmek duyu reseptörleri için her monofilament uygulama arasında 30 saniye bekleyin.
11. Eğer 10 çalışma var kadar olumlu veya olumsuz yanıtlarına göre arka ayak daha yüksek veya daha düşük monofilament uygulamaya devam edilir. Sonra diğer arka ayak üzerinde tekrarlayın. (Örneğin veri bakınız).
12. Proprioseptif girdi tanıtılması ve pençe kaldırmadan test edilebilir en yüksek VFH 6.10 olduğunu. Pençe monof önce kaldırır, çünkü 6.45VFH ve daha büyük kullanılmamalıdırilament eğilir. 6.10 hiç tepki yoksa daha sonra bir sonraki duruşma yine 6.10 uygulanacaktır.
13. Bir yanıt iptal edilmeli ve aşağıdakilerden birini uyaran uygulama veya pençe çekme sırasında oluşursa deneme yeniden test edilmelidir:
    1. Rat sürekli yemek değildir.
    2. Sıçan imkansız çekilme yanıtı ortaya çıkarır uygulanan kuvveti bilmek yapmak, monofilament eğilme önce uzak VFH uyaran hareket eder.
    3. Pençe dokunma uyarısına ek olarak proprioseptif sağlayan VFH (önce ya da sonra VFH bükülür ya) tarafından kaldırılmaktadır.
14. Bir test seansının genellikle her iki arka ayaklarında için en az 15 dakika içinde tamamlanabilir.

YUKARI-AŞAĞI YAKLAŞIM C. BİLGİ İŞLEM

1. Başarılı bir testi, her pençe için 10 ardışık denemeler olacaktır.
2. Dokunsal eşik değeri & g pençe çekme üretir düşük olan monofilamane; sunumlar ve monofilament 3 veya daha fazla sunum% 50 (örneğin veri, eşikler ıçine edilir bakınız) verilecektir var.
3. Sadece 2 toplam çalışma ile monofilament bir deneme pozitif ve bir negatif bile eşik olarak seçilir. Uyaranın Çoklu sunumlar bu kuvvete tepki desen daha iyi göstergelerdir.
4. Testlerden en az% 50 üzerinde olumlu yanıtları üreten herhangi bir monofilaman varsa, sıçan 6,45 bir skor verilir. Bu sıçan rastgele şansın ötesinde 6.10 en yüksek sınanabilir monofilament tespit etmedi anlamına gelir. Bu monofilament sınanabilir aralığı daha yüksek sonraki değeri temsil ettiği için 6.45 değeri verilir.
5. Gram yürürlüğe sağ ve sol patilerini için eşik değeri dönüştürün. Gram kuvveti değerleri von Frey kılların tedarikçisi tarafından temin edilir. . Ikili yaralanmalar veri için iki pençeleri için eşik gram kuvvet elde etmek için birlikte ortalama edilebilirtek bir puan.

2. Dorsal VON FREY TESTİ

Bu testin amacı da tipik plantar VFH yöntemler kullanılarak test edilemez böyle zayıf motor kontrolü ile sıçanlarda dokunma hassasiyeti belirlemektir. Bu dokunma gücü caydırıcı bir yanıt üretmek için gerekli ne kadar rakamlarla. Proprioseptif uyarılara yanıt önlemek için, pençe uygulama sırasında VFH tarafından hareket edildiği çalışmalar dahil değildir. Ayrıca, VFH kayıyor veya ayak dorsal yüzeyi boyunca fırçalanmış olduğu çalışmalar dahil değildir.

SIRT VON FREY TESTİ İÇİN A. Klorofenoller PROSEDÜRLER

1. Temel test ve omurilik yaralanması önce 10 dakika her dört seans için Nazik sıçanlar.
2. Kıç (Şekil 1B) aşağıda gösterildiği gibi maruz böylece gevşek küçük bir havlu sıçan sarın. Arka pençelerinde hafifçe yüzeyi üzerine oturtulmuş bir tablo içinde sıçan yerleştirin. Aynı kullanınrahat ama sıkı sarın ve her bir rat için basılı tutun. Masanın kenarında kolunuzun Askılama sıçanlar arasında değişkenlik azaltabilir.
3. Test için hazır bir mutedil sıçan birkaç ardışık dakika havlu tutuluyor karşı değil, ancak yeniden-sarın sıçan 1 veya arka pençeleri her iki test sırasında 2 kat gerekebilir.

SIRT VON FREY TESTİ İÇİN B. TEST İŞLEMLERİ

1. İlk test başlatmak arka hangi uzuv belirlemek için bir kalıp döndürün. Hatta numaraları sağ pençe temsil ve tek sayılar sol temsil eder.
2. Gevşek maruz kıç bırakarak havlu sıçan sarın.
3. Dokunsal uyaran sıçan en az 10 saniye boyunca sakin ve sessiz ancak sonra uygulanır.
4. 4,56 VFH ile başlayarak, (Şekil 1C) müşterek için yaklaşık 1 cm proksimal birinci ve ikinci metatarsal arasında dorsal yüzeyi dik monofilaman uygulanır. Pürüzsüz, ste içinde monofilament uygulayınbir saniye aralığında ady şekilde eğilir sonra çıkarmak kadar. Bu tek dokunmatik bir deneme teşkil etmektedir.
5. Sıçan hızlı uyaran uzağa hareket ettirdiğinde pençe pozitif tepkisi oluşur. Hareket yönü arka bacak fleksiyonda önce genellikle posterior veya harici olduğunu. Geri çekilme yanıtı monofilament uygulama ile ilişkili olduğunu teyit etmek için monofilament kaldırılır zaman başlatılması gerekir.
6. 4.56 monofilament duyu "windup" önlemek ve duyu reseptörleri (adaptasyon) engellemek için yeniden test önce ateş başlangıca geri gelmek için izin vermek için uygulamalar arasında en az 30 saniye ile iki kez daha uygulayın.
7. Bir uyaran testi VFH kayması durumunda yeniden uygulanır ve nazikçe bir fırçalama ya da daha doğrusu sivri bir kişi daha süpürme gücü teslimat fazla yapma, cildin grazes edilmelidir.
8. 4.56 monofilament 2 (yani 1 ya da 0) daha az olumlu tepkiler varsa, bir sonraki büyük VFH 3 uygulanırAynı şekilde kez.
9. Bu şekilde, iki ya da daha pozitif yanıtları gerçekleşinceye kadar 5,88 yoluyla 4.56 den daha büyük VFHs aşamalı olarak uygulanır ya da büyük VFH ulaşılana kadar.
10. Pençe çekme eşiği 3 denemeler dışında en az 2 pozitif tepkiler ortaya çıkarır düşük VFH olduğunu.
11. Diğer pençe tekrarlayın.
12. Bir test seansının genellikle arka pençeleri her ikisi için de 15 dakika içinde tamamlanabilir.

3. Temsilcisi Sonuçlar

Başarılı bir testi eklem (Şekil 1C) gelen orta plantar bölgeye (Şekil 1A) veya ^1. ve ^2. metatars 1 cm arasında dorsal yüzeye dik uygulanan VFH için arka ayak derhal, tempolu geri alınmasına yol açar . Bu tepkiler her arkadaki pençeyi için dokunsal eşik türetmek için sayımı edilir. Plantar VFH eşikleri elde akut SKY dorsal VFH testlerden Tactile eşikleri mükemmel bir vefa gösterdiKronik kez (Şekil 2) d. Plantar veya dorsal testlerden elde dokunsal eşikleri düşüşler dereceli SCI (Şekil 3 ^3,5) oluşabilir. Bu aşırı duyarlılık SKY sonrası gibi erken 7 gün olarak tezahür eder ve deney ^3-4,6 süresince korunur. SCI şiddeti bir dizi pençe dokunma duyu eşikleri etkilemez iken, eşikler düşüşler daha şiddetli SCI (Şekil 3) oluşur. Önemlisi, aşağıda düzey allodini gelişimi lezyon merkez üssünde beyaz cevherde fazla% 60 bir kayıp olduğunda meydana gelen bir ya hep ya hiç yanıttır. (Şekil 4 ^3).

Dokunsal eşikleri çürümeye ve düşük VFH kuvvetlerine yapay yanıtlar üretebilir. En az iki koşul eşik çürümesine üretebilir - hızla uyaran uygulamalar arasında yeterince uzun süre bekleyen bir alay ya da batıcı tarzda cilde VFH uygulayarak ya da değil. Emin olmakdokunma eşikleri gerçek vardır, bakım benzer bir düşük hız yaklaşım ve interstimulus aralığı en az 30 saniye olmalıdır kullanan her VFH uygulamaya alınmalıdır. Ayrıca yeme davranışı eşik çürümesi ⁵ azalttığını göstermiştir.

Şekil 1. Plantar ve dorsal von Frey saç (VFH) test için VFH stimülasyon konumunu gösteren şematik ve fotoğraf. A) plantar VFH testi için, von Frey saç, yavaş ile orta parmak kemiği (as sıçanın sol arka ayağını plantar yüzeyi şemada kırmızı kutu ile gösterilir) yaklaşık 1 cm posterior orta plantar sıçanın sol arka ayağını dik uygulanmalıdır tutarlı hız bükülecek kadar. Fotoğrafını gösterildiği gibi dorsal VFH teknik için B ve C), sıçan gevşek cerrahi bir havlu sarılır. VFH birinci ve ikinci metatarsal approximatel arasında pençenin dorsal yüzeyi uygulanıreklem proksimalinde y 1 cm.

Şekil 2. Dorsal von Frey Saç duyusal eşikler standart plantar VFH ile bağlantılıdır. (N-44; Pearson katsayısı = 0,503, p <0.01, r2 = 0.67). Kesik çizgiler Dorsal VFH veya plantar VFH teknikleri kullanarak allodinik hissi için kesim eşik değerinin göstermek ve Dorsal VFH testi kullanılarak SKY 7 gün sonra allodinik eşikleri plantar VFH yöntemlerle belirlenen kronik aşağıda düzey allodini tahmin olduğunu göstermektedir.

Şekil 3. Erken dorsal von Frey Saç duyu eşikleri daha sonra timepoints az yaralanma şiddeti karşısında allodinik ve non-allodinik dokunma hassasiyeti tahmin. Karşılaştırılabilir duyusal eşikler 7 gün sonrası SKY Dorsal VFH ve 28 gün sonrası SKY plantar VFH önlemler arasında oluştu. Olağanüstü bir benzerlik için oluştu önemli allodini ile SKY geniş, orta şiddetli SCI (diğer tüm gruplara göre p <.05 1.1 mm deplasman) kaydedildi.

Şekil 4. SKY sonrasında 6 hafta sıçanın sol arka ayağını allodini gösteren laminektomi (hiçbir SCI) alan sıçan ve SKY grupların yüzdesi. Allodini sadece dokunma uyarısına orta veya şiddetli SCI (OSU ESCID cihaz 0.9, 1.1, 1.25, 1.3 mm kablo deplasmanları) hafif SKY ratlarda (0.3, 0.5, 0.7 mm omurilik deplasmanları) sergilenen, normal süre ve yanıtları ile sıçanlarda görüldü. Temsilcisi koronal omurilik bölümleri laminektomi için lezyon merkez üssü (yaralanmamış kontrolü) de miyelin için boyanan, hafif (0.5 mm deplasman), orta (1.1 mm deplasman) ve ağır (1.3 mm deplasman) spinal kord kontüzyonları aksonal derecesini göstermek için dahil edilmiştir Bu aşırı duyarlılık ile ilişkili olduğu koruyucu. (Ölçek çubuğu = 0,5 mm).

k ">

Şekil 5. Yukarı-aşağı von Frey saç testi için örnek bir veri sayfası. Saç değeri ve sonuç (pozitif veya negatif) her bir deneme için kaydedilmektedir. Test supraspinal farkındalık Endikasyonları belirtilmiştir. Testin sonunda her bir saç değerde yanıtları sayımı edilir. Örneğin veri için seçilen eşik değerini daire edilir.

Discussion

VFH test yöntemleri hassas ve sıçan SKY modellerinde kullanılmak üzere geçerli olan iki test paradigmaları temsil sunuldu. Önemlisi, dorsal VFH testi fareler kendi kıç üstünde duramayabilirsiniz zaman akut orta torasik SKY sonrasında arka pençelerinin dokunsal kurtarma değerlendirilmesi için oluşturuldu. Sıçanlarda kendi ağırlığı destek ve servikal SCI'de arka bacak için yeteneği geri kazanmak Bu test paradigma da kullanılabilir.

İki paradigma burada her bir arka pençenin dokunsal eşik belirlemek için ayarlanmış VFH kullanan göstermiştir. Diğer yöntemler normalde zararsız veya normalde zararlı uyaranın ya geri çekme konusunda sıklığını belirlemek. Biz daha önce dokunsal eşikleri küçük iyileştirmeler kronik nöropatik ağrı ve normal bir dokunma hissi varlığı arasındaki farkı temsil edebilir göstermiştir. Bu nedenle ağrı eşikleri may fa türetmek deneysel test yöntemleri kullanılarakpotansiyel terapötik müdahalelerin kliniğe çeviri cilitate.

Bütün davranış testi olduğu gibi, davranışsal testi ⁹ sonucunu etkileyebilecek test ortamında karıştırıcıların sayısını en aza indirmek için zorunludur. Böylece, her bir test aktif aynı sıcaklık ve nem kontrollü bir odaya, günün aynı anda gerçekleşir olması önemlidir. Rat ultrasonik aralığında sesli iletişim Buna ek olarak, kendi test başlamadan kadar test için bekleyen sıçanlarda ayrı bir odada tutulması önemlidir. Langford ve ark ¹⁰ naif hayvanların zararlı uyarılara maruz kalan bir cagemate tanık olduktan sonra ağrı olduğu dramatik bir kanıt gösterdi. Daha dokunma duyusal test değişkenliği ortadan kaldırmak için, biz plantar VFH test sırasında bilişsel distraktör olarak şekerli tahıl kullanmaktadır. Böylelikle, bu hayvanın yanıtları stabilize. Eşik boyunca çürümeye daha az olasıdırBir distraktör biri ⁵ olmadığında den temin edildiğinde test etme. Bu istikrar olasılıkla hypervigilant ve felaket düşüncesi, davranışları, ağrı tehdidi beyinde korku ve duygusal merkezini harekete iki beklenti devletlerin temperleme kaynaklanmaktadır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Semmes-Weinstein Monofilaments	Stoelting Co.	58011
Fish Breeder Box	Any Supplier		Hole drilled in side for cereal delivery
Elevated wire mesh (1/4" X 1/4" grid)	Hardware Store
Elastic to hold fish breeder box in place	Any Supplier
Sugared Cereal	Grocery Store
Surgical Huck Towel 16"x 23"	Medical Supply Store