Summary
在小鼠体内，能够检测信息素主要介导犁鼻器（VNO）。在这里，描述一种急性组织VNO切片进行钙成像的准备。这种生理方法允许生活在一个组织中的亚群和/或单个神经元的观察和受体 - 配体识别的方便。
Abstract
彼得Karlson和马丁Lüscher的使用，在1959年1的长期性信息素，首次描述用于种内通讯的化学品。信息素是易失性或非易失性的短命分子2分泌和/或在生物体液，如尿液，已知是信息素的主要来源的液体3,4中。在一个关键的动物模式，如亲属关系5,6， 分层组织 3和7,8性互动的各种信息素通讯牵连，因此直接与特定物种的生存9,10,11相关。在小鼠实验中，能够检测信息素主要介导犁鼻器（VNO）10,12，位于鼻腔的基础配对结构，并在软骨胶囊内。每个VNO有一个管腔13,14允许与外界接触的管状化学世界。感觉神经上皮主要由犁鼻器双极性感觉神经元（VSNS）15。每个VSN的一个单一的枝蔓在一个大的树突状旋钮轴承化学检测16牵连的100微绒毛向管腔结束。 VSNS许多亚群存在。他们表达，从而可能他们认识到17,18的配体（S）的化学感受器，它们是有区别的。两大犁鼻器受体的家庭，V1Rs和V2Rs 19,20,21,22，240 23 120 24名成员组成，分别在单独的层的神经上皮表达。嗅觉受体（ORS）25和甲酰肽受体（FPRs）26,27也表示VSNS。
无论这些神经元亚群，利用遥感信息素相同的下游信号通路是未知的。尽管起到透水钙通道（主要作用TRPC2）在28 TRPC2独立的传导渠道，成熟的神经元的微绒毛已建议 6,29 。由于神经元亚群的数量和特有的器官形态，在VNO目前的信号元素的药理和生理调查是复杂的。
在这里，我们目前的鼠标VNO急性组织切片进行钙成像调查的准备。这种生理方法允许意见，在活组织的天然环境，以前加载FURA - 2AM，钙染料的VSNS一般或个别亚群。这种方法也方便GFP标记的信息素受体的研究，是适应使用其他荧光钙探针。作为一个例子，我们在这里使用一个VG鼠标30行，在这种信息素V1rb2受体的翻译与一个多顺反子策略，以GFP表达。
Protocol
1。剖析鼠标VNO
- 使用成年小鼠。由于信息素传感multimodalities牵连，小心株，基因型，性别和年龄之间的区别是重要的，会影响你的结果。在这里，我们选择成人VG的小鼠30以前用于识别信息素受体 的一双（2 -庚酮，V1rb2）31（ 图1A） 。
- 开始解剖之前，准备鲜冷人工脑脊髓液（学联; 118毫米氯化钠，碳酸氢钠3 25毫米，10毫米D -葡萄糖，氯化钾2毫米，氯化镁2毫米的NaH 2 PO 4 1.2毫米，氯化钙2 2毫米; pH值7.4）oxycarbon（95％O 2饱和：5％CO 2）。为此，除氯化钙混合所有学联组件。饱和与oxycarbon直接冒泡的解决方案。最后，添加氯化钙和DDH 2 0调整到所需的量。继续，直到ü冰学联解决方案SE。
- 鼠标安乐死应优先做实验前颈椎脱位或CO 2吸入。
- 剪下小鼠的头部。将其放置在寒冷学联解剖不断oxycarbonated显微镜下。
- 切下颌，头部的位置，以可视化腭裂（ 图1B） 。
- 在腭部的上半部分用微型剪刀（ 图1B）水平做一个切口，并删除与微观解剖钳腭膜。水合物和清洁暴露腔学联（ 图1C）。
- 剪下的上部和下部的鼻中隔（ 图1C）。娇柔提取鼻中隔包含VNO和学联，它直接放置在冰（ 图1d） 。
- 垂直分离VNO两部分组成，使用微解剖钳和微妙删除的犁鼻软骨胶囊（图1E）。确保所有的软骨片被删除。
2。 VNO组织切片准备
本节2）中所述的VNO组织切片准备，主要是钙成像调查。 VNO片也可用于浮动片immunohistostainings验证的组织结构的完整性（请参阅第3节）的协议）。
- 准备低熔点琼脂标准的PBS（3％）和您的工作场所。您将需要学联，切片和支持，微解剖钳，嵌入模具（22 × 22 × 20毫米），精密抹布，刷子，组织培养板，cyanacrylat胶，冰和温度计。
- 填写3％低熔点琼脂嵌入模具。确保温度不超过41 ° C垂直放置在短期内消灭VNO（ 图2A），能够获得冠状切片。
- 广场上的冰嵌入模具1分钟，直到凝固，然后将它单独从琼脂块。在金字塔形状的琼脂块切的地方用胶水切片机的支持（ 图2B）。
- 切断与切片机冠状VNO片，0.5毫米/秒，0.7毫米的幅度和冷学联100微米厚度的速度和收集之前，他们在组织培养板填充用冷水的组织切片用毛笔学联。
- 如果你的片包含像GFP的内源性荧光（在基因靶向神经元），你可以选择下一个荧光体视显微镜（图2C）。
3。 VNO浮动片上的免疫组化
此过程的目的是验证VNO组织切片获得第2）的完整性。乙酰-微管蛋白是微管/ VNO感觉神经元的树突和微绒毛细胞骨架的标记表示。钙离子成像实验，去方向TLY到第4节）的协议。浮动VNO片immunohistostaining方法可适应任何感兴趣的蛋白质表达的评价。为此，我们建议您1H修复VNO 4 ° C在固定液（4％多聚甲醛的PBS，pH值7.6）后的1.7点），在pH 7.6的协议，并从这个角度PBS使用，而不是学联的解决方案。
- 在组织培养板，固定片兴趣在固定液（4％多聚甲醛的PBS，pH值7.6）上半年在4 ° C。
- 座在用含0.5％的农工商（正常山羊血清）10％和Triton X - 100解决方案的组织切片在4℃过夜。
- 片与初级抗体（抗-乙酰-微管蛋白，鼠标，1:2000）孵育室温（RT）在PBS含0.25％的农工商5％和Triton X - 100的解决方案为16H。
- 洗为5分钟，用PBS解决方案包含农工商2％的3倍。
- 在黑暗中孵育与塞科ndary抗体（Cy5的标记的羊抗鼠，1:200）在用含农工商为1h，在室温下2％的解决方案。
- 5分钟，用PBS含有农工商2％洗3次，PBS农工商1％和PBS只。
- 安装在一个荧光的安装介质（含有或不DAPI）片放置在疏水分隔区（使用疏水笔）的中心，并用盖玻片盖住片。
- 用共聚焦显微镜和一个软件，让三维重建（图2D - F）的意见和收购。
4。 VNO片钙成像
- 下列程序将在黑暗的地方。孵育VNO片为1h，在37℃冷学联组成FURA - 2AM（7微米;股票1毫米的解决方案，在DMSO）装载解决方案C和聚醚0.1％（W / V; 2 DDH股票在20％以上的解决方案O）。
- 保持在冰上直到使用oxycarbonation加载片。加载片可以保持3 - 4H。
- 刷在灌注含有学联室装片和保持与组织切片锚（ 图3A）切片。
- 广场上的钙成像显微镜（ 图3B）阶段的灌注腔，并在室温下连续灌注oxycarbonated学联。两极温度控制器的使用温度可适应。
- 加载VNO片（ 图3C - E）的观测与倒置荧光显微镜，与25X或63X的客观和冷静的SNAP - HQ相机。照明是按顺序做（三百八十零分之三百四十零NM）与多色仪和记录在5HZ率。筛选的排放量在510 nm。细胞内钙的比例变化（ΔF= 340 nm/380纳米）的监测与合适的软件。
- Chemostimulation应选择根据你自己的实验目的。在这里，学联灌注含有信息素米IX（isobutylamine，2 -庚酮，4 -庚酮，2 -庚醇，pentylacetate，二甲基，α/β-金合欢烯，10 -6 M），2 -庚酮（10 -6 M）或新鲜采集的男性和女性（1 ： 1）鼠标尿（1:100）执行32。在实验结束时，灌注ATP（125微米）是作为一个可行性测试（图 3F），并应说明可行的神经元约80％的比例。在这些条件下，可以用来片长达2小时。
- GFP标记的感觉神经元亚群，可视具体照明（V1rb2表达神经元），可精确分析（ 图3G）。
5。代表性的成果：
要建立一个功能检测，以调查多转导通路在小鼠犁鼻的地方，或确定新的信息素受体 对，我们的VG鼠标线（图1A 图1E）的提取和清扫后，我们准备了急性VNO片（ 图2C） 。我们修复其中的一小部分，以检查和验证对乙酰化微管蛋白（图2D - F），由执行immunohistostainings tissular完整的准备。切片的其他一小部分用于钙离子成像实验。 ，切片装入FURA - 2AM（ 图3C - E），每个神经元细胞内钙离子水平作为ΔF比例（ 图3F）监测。 ATP（125微米），灌注后，迅速 而短暂的ΔF的比例增加，预计（图3F）的神经元的可行性进行评估。尿液中的信息素的主要来源，灌注新鲜LY鼠标收集尿液（1:100）作为一种内源性的控制。它触发记录的神经元（细胞1和2， 图3F）在大约50％的钙瞬变。 GFP的照明下，V1Rb2阳性神经元观察到，灌注其称为信息素配体，2 -庚酮，启动细胞活化（细胞1，图3I）。有趣的是，神经元的激活也观察到在一小部分神经元不表达V1Rb2受体（GFP负神经元 ）（ 细胞 2，图3I），显示出复杂的犁鼻器信息素编码。
图1小鼠犁鼻器官的解剖。 （A）鼠标从VG线。 （b）在安乐死的鼠标，完整的头被放置在双目显微镜下，下颌被删除，以形象化的腭。小横切口完成（黑色虚线）。 （c）在拆除腭，鼻中隔内衬的VNO是削减在上部和下部（白色虚线），以方便VNO提取。 （四）VNO是定位在学联的解决方案，并分居（插入：更高的权力观两部分）。 （五）的犁鼻软骨胶囊微妙删除，并VNO无软骨胶囊，其余的实验中使用。比例尺：1毫米。
图2小鼠犁鼻急性片制备和tissular完整性。 （一）鼠标VNO是垂直嵌入在琼脂3％溶液。琼脂的温度必须低于41 ° C。 （二）琼脂块是金字塔形状和切100微米VNO部分（黑色虚线）在学联产生。 （三）VNO片，可以选择一个荧光体视显微镜下才能看到一个特定的标签的感觉神经元的人口。 （DF）Tissular完整，可以评估对乙酰化微管蛋白的蛋白质，一个更高的权力观V1rb2基因靶向神经元表现出完美的准备保护immunohistostainings。可以观察到其长期的树突表面到达管腔（五），以及在树突状旋钮和微绒毛的结构蛋白的表达神经元（F）比例尺是：B，5毫米，60微米，D，40微米，EF，20微米。
图3。钙成像和信息素在犁鼻急性组织切片检测。 （a）在一个FURA - 2AM装载阶段，VNO片放置在灌注室，并与维持一个适应的锚（高功率视图）。 （二）实验是在黑暗和VNO片进行连续灌注在室温真空系统与学联。温度可chosEN使用一个温度控制器系统组成一个双极佩尔蒂埃元素和热探头。这种特殊的实验是在室温下进行。 （CE）的VNO片霍夫曼相衬（HV）或前FURA 380纳米照明下观察（D）和（E与ATP）在神经元激活。 （六）神经元的生存能力评估灌注ATP（125微米）。在这里，chemostimulation尿（尿，1:100），或在165毫升/小时的流量恒定的鼠标信息素混合（混合pH值，10 -6 M）细胞内钙水平（ΔF）可以记录每个细胞（细胞1至3）。 （G）V1Rb2神经元是根据绿色荧光照明（1）可视化。 （H）加载这个神经元（1）以及非V1rb2表达神经元（2）所示。 （一）V1rb2神经元是能够与细胞内钙增加2 - 庚酮。这种特殊的非V1rb2表达神经元也响应2 - 庚酮（单元2）。比例尺：行政长官，20微米;生长激素，15微米;ΔF= 340纳米/ 380纳米。 （F和我）刺激应用程序的时间是表示，根据每个跟踪酒吧。任意颜色规模的荧光强度。
Discussion
这里介绍的钙成像方法，使记录，在急性切片制备，小鼠犁鼻器神经元的信息素反应。通过这种方法，从动物解剖的犁鼻器神经元，一些做法，很容易实现，并提供了一个长期生活的组织准备。它允许像药理调查或研究的信息素编码耗时的实验。这种生理的技术，庞大的人口数量以及精确的神经元亚群可以具体分析。此外，这种方法可以很容易地适应其他钙染料为基础的免疫组织化学方法或实验。使用相结合的方法，必将使许多孤儿在小鼠犁鼻器官中表达的化学感受器的新的信息素配体的识别。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢他的科学意见和成像CIF显微镜设备UNIL平台特别是莫尼克Nenniger Tosato她出色的技术支持，以及让 - 伊夫Chatton。由瑞士国家科学基金会提供资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
| Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
| CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
| Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck & Co., Inc. | 317275-100ML | |
| Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
| Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
| FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
| Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
| Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
| MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
| Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
| Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
| Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
| Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
| Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth GmbH | 0258.1 | |
| SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
| Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
| Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
| Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
| Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
| VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
| 3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |
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