Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Agar-embedded Netzhaut Scheiben, die sich für Elektrophysiologie und Ca2 +-Imaging sind. Diese Methode erlaubt es, Band-Typ Synapsen der Netzhaut Mikroschaltungen mit direkten Patch-Clamp Messungen von einzelnen präsynaptischen Nervenendigungen zu studieren.
Abstract
Visuelle Reize werden erkannt und über einen weiten Dynamikbereich von Lichtintensitäten und Frequenzänderungen von spezialisierten Nervenzellen in der Retina vermittelt. Zwei Klassen von retinalen Nervenzellen Photorezeptoren und bipolaren Zellen, dies zu erreichen, indem Sie Lappenkäfig aktiven Zonen, die nachhaltig und mit hohem Durchsatz ermöglicht die Freisetzung von Neurotransmittern über lange Zeiträume. ON-Typ gemischt bipolare Zelle (Mb)-Terminals in der Goldfisch Netzhaut, die auf Lichtreize depolarisiert und erhalten gemischte Stäbchen und Zapfen Photorezeptor-Eingang, sind für das Studium der Band-Typ Synapsen sowohl aufgrund ihrer Größe (~ 10-12 geeignet Mikrometer Durchmesser) und ihre zahlreichen Quer-und wechselseitigen synaptischen Verbindungen mit amakrine Zelle Dendriten. Direkter Zugriff auf Mb Bipolarzelle Terminals in Goldfisch Netzhaut Scheiben mit der Patch-Clamp-Technik ermöglicht die Messung von präsynaptischen Ca 2 + Ströme, Membran-Kapazität ändert, und die gegenseitige synaptischen Feedback-Hemmung durch GABA vermittelte <sub> A und GABA C-Rezeptoren exprimiert auf den Terminals. Präsynaptischen Membran Kapazitätsmessungen der Exozytose erlauben es, die kurzfristige Plastizität der erregenden Neurotransmitter-Freisetzung 14,15 studieren. Darüber hinaus können kurzfristige und langfristige Plastizität inhibitorischer Neurotransmitter-Freisetzung aus Amakrinzellen auch durch Aufnahmen von gegenseitigen Feedback-Hemmung bei der Ankunft am Mb Klemme 21 untersucht werden. Über kurze Zeiträume (zB ~ 10 s), erfährt GABAergen gegenseitige Feedback-Hemmung von Amakrinzellen paired-Puls Depression über GABA Vesikel Pool Erschöpfung 11. Die synaptische Dynamik der retinalen Mikroschaltungen in der inneren plexiformen Schicht der Netzhaut kann somit direkt untersucht werden.
Das Gehirn-Slice-Technik wurde vor mehr als 40 Jahren führte jedoch immer noch sehr nützlich für die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Neuronen, sowohl auf die einzelne Zelle soma, single Dendrit oder Axon, und microcircuit synaptischen Ebene 19. Gewebe, die zu klein, um direkt auf die Schneiden Kammer verklebt werden sollen, werden oft erst in Agar eingebettet (oder platziert auf einem Filterpapier) und dann in Scheiben geschnitten 20, 23, 18, 9. In diesem Video, verwenden wir die Pre-embedding-Agar-Technik mit Goldfischen Netzhaut. Einige der riesigen bipolaren Zellen Terminals in unserer Scheiben Goldfisch Netzhaut axotomized (Axon-cut) beim Schneiden Verfahren. Dies ermöglicht uns, einzelne präsynaptischen Nervenendigung Eingänge zu isolieren, da die Aufnahme von axotomized Terminals schließt die Signale von der soma-dendritischen Kompartiment. Alternativ kann man auch aus intakten Mb Bipolarzellen aufzunehmen, durch die Aufnahme von Klemmen befestigt Axone, die nicht beim Schneiden Verfahren geschnitten wurden. Insgesamt wird diesen experimentellen Protokoll in Studien der retinalen synaptischen Physiologie, microcircuit funktionale Analyse und synaptische Übertragung an Synapsen Band zu unterstützen.
Protocol
1. Externe und interne Lösungen
- Bereiten Slicing-Lösung (niedrige Calcium) ab 10x Stammlösung und fügen MgCl 2, CaCl 2, und D-Glucose täglich. Die endgültige 1x Lösung besteht aus (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 3,2 MgCl 2, 0,25 CaCl 2, 12 D-Glucose, 0,2 L-Ascorbinsäure, 12 HEPES. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 (mit NaOH), und passen Sie Osmolarität auf 260 mOsm (mit H 2 O und 10x Stammlösung).
- Abwiegen 3% niedriger Gelier-Temperatur-Agar (Agarose Typ VII-A, A0701, Sigma, Rieke, 2001) und mischen sich mit Slicing-Lösung. Erhitzen Sie das Agar-haltigen Lösung in der Mikrowelle für 1-2 min, oder bis es vollständig aufgelöst, und inkubieren Sie die Agar-Agar in einem Wasserbad (30-33 ° C), um die rasche Erstarrung (Gel-Übergangstemperatur zu verhindern: 26 ± 2 ° C).
- Bereiten Sie die Aufnahme-Lösung (normal Kalzium) ab 10x Stammlösung und fügen MgCl 2, CaCl 2, und D-Glucose täglich. Die endgültige Lösung 1x konsets (in mm): 100 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 0,2 L-Ascorbinsäure, 2,5 CaCl 2, 12 D-Glucose. Nach sprudelnden die Lösung in 95% O 2 / 5% CO 2 (Carbogen) für 5-10 Minuten, stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 (mit NaOH), und passen Sie Osmolarität auf 260 mOsm (mit H 2 O und 10x Stammlösung).
- Aliquots (1 ml) der internen Pipette Lösungen sind im Voraus hergestellt und gelagert in einem Gefrierschrank (-20 ° C). Zwei interne Pipette Lösungen sind in der Regel verwendet, um bipolare Zellen Calcium Ströme (in mM) zu isolieren:
- 40 CsCl, 60 Cs-gluconat, 10 Tetraethylammonium (TEA)-Cl, 28 HEPES, 3 Mg-ATP, 1 Na-GTP und 2 EGTA. Der pH-Wert auf 7,2 (mit CsOH) und Osmolarität eingestellt auf 250 mOsm. Diese hohe Chlorid-interne Lösung typischerweise niedrigeren Vorwiderstand Aufnahmen (besser Voltage-Clamp-Bedingungen) und größeren inhibitorischen postsynaptischen Ströme (IPSCs) bei einer bipolaren Zelle Ruhemembranpotential von -60 mV.
- 95 Cs-Gluconat, 10 TEA-Cl, 25 HEPES, 3 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP und 0,5 EGTA. Der pH-Wert auf 7,2 (mit CsOH), und legen Osmolarität auf 250 mOsm 22. Dieser niedrige EGTA interne Lösung führt üblicherweise zu höheren Membrankapazität Veränderungen, hervorgerufen durch depolarisierende Schritt Impulse und ermöglicht damit Studien von Vesikel-Pool Erschöpfung und kurzfristige Depression.
2. Patch-Clamp Pipette Elektroden
- Bereiten dickwandigen (1,5 mm Außendurchmesser) Borosilikatglas (1B150F-4; World Precision Instruments, Sarasota, FL) und ziehen Sie die Patch-Pipetten mit einer vertikalen Puller (Narishige, PP830, Tokyo, Japan). Open-Spitze Patchpipette Widerstände in Recording-Lösungen sind 7-8 MOhm, wenn die Pipette mit internen Pipettenlösung Nr. 1 gefüllt ist.
- Bestreichen Sie die Patch-Pipette gleichmäßig, von der Spitze bis zur Höhe der Welle, dass die Pipettenhalter mit Dentalwachs (Cavex, West Chester, PA) erreicht. Dies minimiert die Pipette Kapazität und elektrisches Rauschen und ermöglichengenauer und Low-Noise Kapazitätsmessungen. Eine niedrige Pipette Kapazität hilft auch der elektronischen C-schnell (schnelle Kapazität) Kompensation der EPC-9 (oder EPC-10) Patch-Clamp-Verstärker.
3. Vorbereitung der Agar-embedded Netzhaut Scheiben
- Wählen Sie einen Goldfisch (Carassius auratus, 8-16 cm) und in einen abgedeckten Eimer in einen dunklen Raum für 30 min Dunkeladaptation. Nach der Anästhesie, euthanize die sediert Goldfische durch schnelle Enthauptung, und doppelklicken Sie Rückenmarkzerstörung des Rückenmarks und des Hirnstamms. Dann entfernen Sie die Augen mit geschwungenen-Spitze Schere und gekrümmter Spitze Pinzette. Diese Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Oregon Health & Science University genehmigt worden.
- Hemisect jedes Auge durch Schneiden gleichmäßig um den vorderen Teil des Auges mit Feder Schere (15003-08, Fine Science Tools, durch Punktion mit Schere geschnitten Tipps zu initiieren), und legen Sie die Augenmuscheln in gekühlte Scheibe Lösung (geringe Calcium). Wenn necessary, entfernen Sie das Objektiv mit einer Pinzette (die Linse wird in der Regel mit dem vorderen Teil des Auges lösen). Entfernen Sie die Netzhaut mit Pigmentepithel durch ein Paar von 45 ° abgewinkelten Spitze feinen Pinzette (11251-35, Fine Science Tools) zu schälen die Netzhaut weg von der Augenmuschel, langsam voran um den vollen 360 ° angebracht. Sever oder schneiden den Sehnerv entweder mit feinen Pinzette oder Schere Frühjahr. Entfernen Sie die Netzhaut sanft mit einer Kombination aus Winkel feine Spitze Pinzette und Absaugen aus einem modifizierten Pasteurpipette oder Transferpipette (große Spitze) angewendet. Verwenden abgewinkelt feine Spitze Pinzette, um den Rest des Pigmentepithels an der Netzhaut zu entfernen. Die Oberfläche des gereinigten und gesunden Netzhaut erscheinen soll dunkel, glatt und rot gefärbt. Für eine vollständige Entfernung aller dunklen Pigmentepithelzellen dunkel-Anpassung der Netzhaut 1 Stunde (8, 1992).
- Gönnen isolierten Netzhaut mit ~ 0,03% (wt / vol; ~ 0,36 mg / mL in 1x Scheibe Lösung) Hyaluronidase (3; H6254, Sigma) für 15-30 min bei RaumtemperaturTemperatur (20-23 ° C) bis Glaskörper zu entfernen. Während dieser Inkubation können Sie sich vorbereiten eiskalten Scheibe Lösung.
- Schneiden Sie ein rechteckiges Stück Netzhaut (~ 2x2 mm, mit der vollen Dicke der Netzhaut), indem Sie die geschwungenen Kanten mit einem kleinen Segment der Rasierklinge (Personna, zweischneidige, gereinigt mit 70% Ethanol und H 2 O), die an der Körper einer 1 ml Kunststoff-Spritze, und übertragen Sie die retinale Stück zu einem kleinen Behälter mit Agar-Lösung (hergestellt in (1.2)) gefüllt. Versuchen Sie, die Menge der Lösung rund um die Netzhaut zu minimieren, wie es in den flüssigen Agar gelegt wird. Tauchen Sie direkt in eiskaltem Slice-Lösung (hergestellt in (3.3)), um den Agar 20, 18, 9 erstarren. Wir verwenden eine kleine, handgefertigte Behälter. Kurz gesagt, war eine kleine, zylindrische Röhre (Fisherbrand, Polyethylen Probenfläschchen 2,5 ml, 03 bis 338-1B) an beiden Enden abgeschnitten und versiegelt mit Parafilm (PM-996, Pechiney Plastic Packaging) Patches.
- Schneiden Sie die Agar-Block in eine 1x1x1 cm-Würfel mit dem rechteckigen Stück Netzhaut.
- Übertragen Sie die Block auf die Scheibe Kammer und kleben es auf die Oberfläche der Platte schneiden. Die Scheibe Kammer ist in einem Gefrierschrank (-20 ° C) vorgekühlt. Schneiden Sie den Block in 200-250 um dicke Scheiben mit einem Vibratom Allesschneider (VT1000S oder VT 1200S, Leica) in eiskaltem Scheibe Lösung. Insgesamt 5 bis 10 Scheiben können erhalten werden, die lebensfähig sind für etwa 5 bis 6 Stunden.
- Übertragen einer der Scheiben, um die Aufnahme Kammer. Legen Sie ein Raster aus Nylonfäden geklebt, um eine U-förmige Platin Rahmen 19 auf der Scheibe, und perfuse kontinuierlich (von 1-2 ml pro Minute) mit Aufnahme-Lösung mit 95% O 2 / 5% CO 2 (Carbogen sprudelte ).
Trouble Shooting:
Wenn die Netzhaut Stück in der Agar-Block eingebettet ist freistehend oder kommt aus der Agar beim Schneiden kann man die Schichtdicke von 200 mu m auf bis zu 300 um in Schritten von 20 um. Auch versuchen, die Menge der Lösung rund um die Netzhaut zu minimieren, wie es übertragen wird und in das flüssige Agar durch Ansaugen von zusätzlichen Lösung mit einer gerollten "Kimwipe" Papier Spitze. Ein anderer Weg, um dieses Problem zu vermeiden, ist die Größe des retinalen Stück zunächst in den Agar gelegt zu reduzieren. Da Glaskörper verbietet Agar aus voll Befestigung an der Netzhaut Stück, kann es notwendig sein, um frische Hyaluronidase machen oder passen Sie die Inkubationszeit (Schritt (3.3)).
4. Identifizierung der bipolaren Zellen synaptische Terminal in einem Retina-slice
- Position der Netzhaut Scheibe unter dem aufrechten Mikroskop (zB BX51WI, Olympus). Wir sehen die Retina-Schnitte mit Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrast (IR-DIC) Optik durch ein 60x Wasser-Immersions-Objektiv (NA 0,90, Olympus) und CCD-Kamera (XC-75, Sony). Der Ausgang der CCD-Kamera ist eine Kamera-Controller (C2400, Hamamatsu) zur Kontraststeigerung vor der Anzeige auf einem analogen Sony 13 "blac geschicktk-Weiß-Monitor. Das Mikroskop ist auf einem XY-Übersetzung der Bühne montiert, und die Aufnahme Kammer befindet sich auf einer festen Stufe 14 gesetzt.
- Suche entweder intakt und axotomized (Axon-cut) Bipolarzelle Terminals, die durch ihre Größe, Form und Position in der Scheibe (Abbildung 1) identifiziert werden kann. Axotomized und intakte Endgeräte können auch durch die Prüfung ihrer kapazitiven Ausgleichsstrom Abklingzeiten (single exponential gegen doppelt exponentiell abklingt, jeweils) und Ca 2 +-Ströme unterschieden werden (Abbildung 2, 12, 14, 15). In der inneren plexiformen Schicht der Netzhaut Goldfisch; Mb Anschlüsse sind in den meisten proximalen Schicht sublamina b (neben Ganglienzellschicht ON-Schicht) entfernt. Mb-Terminals, mit ihrer matten Oberfläche und flache Aussehen, kann leicht von Ganglienzellen und Vertriebenen amakrinen SOMAS, die Phase-hell und sphärische erscheinen unterschieden werden. Darüber hinaus ist der Rand der Mb-Terminals mit einem hohen abgedecktDichte der synaptischen Kontakte und erscheint rauh und unregelmäßig, wenn die glatte, saubere Oberflächen von Ganglienzellen und Amakrinzellen (Abbildung 1a-c) verglichen. Axotomized Mb Terminals erscheinen rund und in der Nähe runden (Abbildung 1c), während intakte Terminals elliptische und streckte erscheinen, oft mit einem eingeklemmten Ende in Richtung des inneren Körnerschicht der Netzhaut (Abbildung 1a, b).
- Beschädigte oder ungesund Terminals sehen oft geschwollen und zeigt mehrere kleine körnige Strukturen auf der Oberfläche. Es kann möglich sein, eine GOhm Siegel an diesen Anschlüssen zu erhalten, aber sie sind wahrscheinlich zu brechen kurz nach Einbruch. Andere Anzeichen von ungesunden Terminals gehören ein hohles Aussehen, Kontrast und / oder Helligkeit identisch mit der umgebenden Scheibe, und manchmal Lage an der Oberfläche der Scheibe. Es ist möglich, sowohl von gesunden Terminals tief in die Scheibe (Vorteil: mehr intakt synaptischen Schaltungen) aufzeichnen und auch in der Nähe der Oberfläche der Scheibe (advantage: schneller Zugriff auf perfundierten Drogen in der externen Lösung, einfacher Dichtung).
5. Elektrophysiologischen Ableitungen und Ca 2 +-Imaging
- Mit einer Spritze mit einer 0,2 um Filter-Spitze (Nalgene), füllen Sie das Glas Patch-Pipette mit internen Lösung auf ein Niveau 1-2 cm von der Rückseite der Pipette. Nach Entfernung von Luftblasen aus der Spitze, sichern Sie die Pipette in die Halterung, gelten Überdruck (1,2 bis 1,6 psi), und verschieben Sie sie in Richtung der angestrebten Terminal mit einem Mikromanipulator (MPC-200, Sutter Instrument). Während der Bewegung der Spitze nach unten durch die Scheibe, bewegen Sie die Pipette in einen seitlichen geschwungenen Richtung, um sicherzustellen, dass die Scheibe nicht mit der Spitze gezogen.
- Bewegen Sie die Pipettenspitze in das Terminal an der Membranoberfläche zu reinigen. Schieben Sie die Spitze nach unten auf den Rand des Terminals ein Grübchen (Gedankenstrich) zu erstellen, und lassen Sie die positiven Druck. Wenn ein GOhm Dichtung nicht unmittelbar zu bilden, mit leichtem Unterdruck. Nach einem GOhm Siegel, um die on-cell recording Modus des EPC-9 Patch-Clamp-Verstärker einschalten und ändern Sie die Haltepotential bis -60 oder -70 mV. Übernehmen Sie die C-schnelle (fast-Kapazität) Korrektur, für die Dichtung warten, um zwischen 5-10 GOhm zu stabilisieren, und dann reißen die Membran mit scharfen, sanfte Saugwirkung durch den Mund eingesetzt, um die whole-cell recording Konfiguration herzustellen. Wenn der whole-cell-Konfiguration korrekt eingerichtet wurde, wird Serienwiderstand zwischen 14-30 MOhm sein. Eingangswiderstand wird 200-500 MOhm für intakte Terminals und 1-3 GOhm für axotomized Klemmen 14 werden.
- Beachten Sie die kapazitive Strom transient (Abbildung 2a und 2c), um zwischen intakten und axotomized Bipolarzelle Terminals zu unterscheiden. Intakte und axotomized Mb Terminals haben eine Grundlinie Membran Kapazität von 9-16 pF und 3-8 pF bzw..
- Tragen Sie einen 200 ms Dauer Voltage-Clamp Schritt von -70 bis 0 mV zu einer axotomized Mb Terminal. Dies ermöglichtdie direkte Messung von großen (~ 200-600 pA), isoliert nach innen Ca 2 + Ströme durch die Öffnung der spannungsabhängigen L-Typ Ca 2 +-Kanäle aktiviert (Abbildung 2b). Parallel dazu wird man in der Lage, die Kapazität zu springen durch die Exozytose von synaptischen Vesikeln verursacht, und die schnelle, pH-vermittelte Hemmung der Ca 2 + Strom, der Exozytose 15 folgt, und GABAergen gegenseitige Feedback-Hemmung (Abbildung 3c; 22) zu überwachen. Wenn man Patches eine intakte Mb Bipolarzelle Terminal wird das Ergebnis wie in Abbildung 2c und 2d gezeigt werden. Keine erkennbaren Ca 2 + Ströme sind wegen der großen "Leck" Ströme durch Gap-Junction-Kopplung in die Dendriten der Mb Bipolarzellen 1 beobachtet.
- Membrane Kapazität Veränderungen können durch einen Schritt Depolarisation aus dem Betrieb Potential von -70 mV auf 0 mV mit dem "Sinus + DC"-Methode der zeitaufgelösten Membrankapazität Messungen 6 hervorgerufen werden. Membrane Kapazität Sprünge zeigen die Fusion synaptischer Vesikel mit der Plasmamembran. A 2 kHz Sinus-Voltage-Clamp-Befehl (30 mV Peak-to-peak) wurde die Haltung Potential von -70 mV aufgenommen. Die Aufnahme von Strom wurde in zwei orthogonal Phasenwinkel von der EPC-9 Patch-Clamp-Verstärker Software-Emulation des analysierten einem Lock-In-Verstärker (HEKA, Lambrecht, Deutschland). In der intakten Anschluss Abbildung 2d, eine hohe Frequenz (2 kHz) sinusförmige Anregung Grenzen der Membran Kapazität, die an das Terminal Endungen und Axon, das eine Grundlage Kapazität Cm haben ~ 6,8 pF analysiert wird. Die Membran der Zellkörper und Dendriten der bipolaren Zellen sind somit durch die hohe Frequenz Voltage-Clamp-Sinus 13 gefiltert.
- Für Ca 2 +-Imaging-Experimente, gründlich mischen die interne Patch-Pipette Lösung mit einem Ca 2 +-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff (zB Oregon Green 488 BAPTA-1 (100-200 pM; O-6806, Invitrogen)), und wiederholen Sie das Protokoll aus 50,1 bis 5,5. Dies ermöglicht ein bis Fluoreszenz-Bildgebung und elektrophysiologische Ableitung zu kombinieren. Zum Beispiel ist es möglich, Bild der Ca 2 + transient mit einem 200 ms Schritt von -70 bis 0 mV in der kleinen telodendria Anhängsel der Mb-Terminal (Abbildung 3a, b) verbunden. Wir haben unsere aufrechte Olympus Mikroskop mit einer sich drehenden Scheibe Laser konfokalen Mikroskop-System (CSU-X1, Yokogawa) integriert. Das konfokale Mikroskop benutzt 488 nm und 561 nm Laser-Linien, moduliert durch einen akusto-optischen abstimmbaren Filter sind. Die Daten werden aufgenommen mit Slidebook Software (3i; Intelligent Imaging Instruments). Für weitere Informationen zu Kalzium-Imaging-Techniken mit Goldfischen Netzhautneuronen siehe 24, 17, 3.
Trouble Shooting:
Wenn man nicht häufig zu einer whole-cell-Konfiguration einzurichten, auch nach Bildung einer stabilen GOhm Dichtung, kann es hilfreich sein, um den Unterdruck zur Punktion reduzieren das Terminal michmbrane. Es kann auch sein, dass eine optimale Saugdruck für die Einrichtung von Ganz-Zell Konfiguration als Funktion der Membran Krümmung (soma> Terminal) variiert werden. Es ist auch möglich, ein zap-Protokoll (Amplitude: 400 mV, Dauer: 100 us) verwenden, um die whole-cell-Konfiguration geben, entweder allein oder in Kombination mit einem scharfen Puls der Unterdruck. Wir haben die zap-Protokoll erweist sich als besonders nützlich für die break-in bei der Verwendung einer Pipettenspitze mit einer Badewanne Widerstand von mehr als 12 MOhm.
6. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Bezeichnung des Mb Bipolarzelle Terminals in Goldfisch Netzhaut Scheiben schneiden. (Ac) IR-DIC Bilder Mb Bipolarzelle Terminals. Wir können ermitteln, wahrscheinlich axotomized (Axon-cut) und intakt Terminals in den IR-DIC Bild. Ein axotomized Terminal erscheint rund und kreisförmig, wie in c gezeigt,während ein intaktes Terminal ist eher erscheinen elliptisch, wie in a und b dargestellt. Diese Klassifizierung kann durch transiente Kapazitätsmessung (siehe Abbildung 2) oder durch den Farbstoff Füllverfahren (- f d) bestätigt werden. Rote Pfeile angedeutet die Lage der Schnittpunkte zwischen dem Axon und Axon-Terminal für die intakte Terminals in a und b. Red gepunktete Linie angedeutet die Kontur Mb Bipolarzelle Terminals. (Df). Fluoreszenz-Bilder von Mb Bipolarzelle Terminals mit einer intakten Axon (d), eine teilweise geschnittene Axon (e), oder eine komplett entfernt Axon (f). Alexa 555 (A20501MP, Invitrogen) Fluoreszenzfarbstoff wurde mit internen Lösung vor, um die Aufnahme gefüllt. Unmittelbar nach dem Patch-Clamp-Aufnahme wurde die Retina Scheibe in 4% (wt / vol) Paraformaldehyd (P6148, Sigma) in Phosphat-Puffer-Lösung (70.013, GIBCO) überführt und für 30min. Scheiben wurden auf Superfrost Objektträger (Fisher Scientific) in wässrigen Eindeckmedium mit Anti-Fading-Agenten (Biomeda corp) montiert. Alexa 555 mit Mb Bipolarzelle Terminals wurden mit einem 555 nm Laser-Linie (rot) mit einem 40x Wasser-Immersions-Objektiv auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (LSM 710, Carl Zeiss) betrachtet. Beachten Sie das Vorhandensein von kleinen telodendria Anhängsel ragen aus der Axon-Terminals (blaue Pfeile). Maßstabsleiste zeigen 10 um (a - f). INL: innere Körnerschicht, IPL: innere plexiforme Schicht, GCL: Ganglienzellschicht.
Abbildung 2. Elektrische Eigenschaften von axotomized und intakte Mb Bipolarzelle Terminals. (A, c) Transient aktuelle Antwort von einem Voltage-Clamp Schritt Hyperpolarisation aus dem Betrieb von -60 mV bis -70 mV aktiviert. Die kurze aktuellen Antwort auf eine -10 mV Voltage-Clamp-Schrittkann zur Folge haben: 1) eine einzige schnelle exponentielle Abklingen mit hohen Eingangswiderstand bei -70 mV (indikative Angaben eines axotomized Terminal; Panel a), oder 2) ein Doppel-exponentiellen Abfall mit niedrigem Eingangswiderstand bei -70 mV (indikativ für ein intaktes Terminal; Panel c, siehe auch 12, 14, 15). (B, d) Ca 2 + Ströme und Membrankapazität Sprünge wurden von einem Schritt Depolarisation von -70 bis 0 mV hervorgerufen. Zeitaufgelöste Membran Kapazitätsmessungen ein 2-kHz Sinus Reiz auf den ruhenden Haltepotential von -70 MV 6 überlagert. Die rote Kurve ist der gemittelte Wert der Kapazität Datenpunkte. Beachten Sie, dass die Kapazität Sprung in Abbildung 2b und 2d sind beide gleich etwa 200 fF.
Abbildung 3. Direkte Messungen der Ca 2 +-Imaging-Signale, Exozytose und inhibitorischen Feedback in einem Mb bipolare Zelle Terminal. (A) Ein vorübergehender Anstieg der Ca 2 +-Konzentration in der telodendria einer Mb-Terminal wurde von einem Voltage-Clamp Schritt Depolarisation von -70 bis 0 mV für 200 ms (Pfeil) aktiviert. Oregon Green 488 BAPTA-1 (100 pM), einem Ca 2 +-Indikator-Farbstoff, wurde in der Patch-Pipette aufgenommen. (B) Entsprechende Fluoreszenzbild des Mb telodendria (region of interest durch rot gepunktete Linie angedeutet). (C) Kurzfristige synaptische Depression der Neurotransmitter-Freisetzung (Exozytose). Ca 2 +-Strömen (Mitte trace) und Membran-Kapazität (untere Kurve) durch ein Paar von 20 ms Depolarisationen auf 0 mV (obere Spur; 200 ms Intervall zwischen den Pulsen) hervorgerufen. Der Pfeil zeigt die Wirkung von exocytosed Protonen auf der Ca 2 + aktuelle und auch die GABAerge gegenseitige Feedback-Hemmung aus dem benachbarten Amakrinzellen 15, 21. Beachten Sie, dass die Protonen-vermittelte Hemmung der Ca 2 + aktuelle und auch die GABAergic gegenseitige Feedback-Hemmung sind nur in den ersten depolarisierende Antwort, die auch über eine Kapazität Sprung auf die Exozytose von synaptischen Vesikeln zu präsentieren.
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Discussion
Ein kritischer und schwieriger Schritt in unserem Protokoll ist die Übertragung des Stückes von Netzhaut in den Agar-Lösung (Protokoll 3.4). Es ist notwendig, entfernen Sie vorsichtig den Glaskörper und Rest-slice-Lösung aus der Netzhaut Stück und übertragen sie ohne Verzerrung oder Biegen. Um dies zu erreichen, verwenden wir einen kleinen Spatel (21 bis 401-25B, Fisherbrand) mit einer Spitze gebogen, um einen 90 ° Winkel bilden, zusammen mit gebogener Spitze Pinzette (11251-35, Fine Science Tools), um die Netzhaut Position Stück in den Transfer-Prozess in Scheibe-Lösung. Residual Scheibe Lösung auf der Netzhaut schneiden und Spachtel kann durch vorsichtiges Betupfen der Oberfläche mit der Ecke eines gefaltet oder gerollt Kimwipes (Kimberly-Clark) entfernt werden.
Ein weiteres gemeinsames Weg quer Netzhaut Scheiben vorzubereiten, ist das Filterpapier-basiertes Protokoll 23. Kurz gesagt, ist ein umgekehrtes Stück ganze Netzhaut zu einem Rechteck Stück Millipore-Filter disk (Ganglienzellen lagen befestigter gegen das Filterpapier, Photorezeptorschicht nach oben) und Schnitt in 250 mu m dicke Scheiben mit einem manuellen vertikalen "thumb" Allesschneider (zB Narishige ST-20). Wir finden, dass die Vorteile der Filterpapier-basiertes Protokoll gesünder Photorezeptoren und eine Erhöhung Verhältnis von axotomized auf intakte Mb Terminals enthalten. Wir benutzen also diese Filterpapier-Methode ans Licht hervorgerufenen Reaktionen von einzelnen Mb-Terminals in der Netzhaut Scheiben eingebettet entlocken.
Die Vorteile unserer Agar-basiertes Protokoll über das Filterpapier-basiertes Protokoll, dass 1) der Netzhaut Scheibe produziert flach ist, auch und relativ unbeschädigt mit klarer Trennung zwischen Netzhautschichten, die das Patchen ermöglicht in jedem inneren Körnerschicht oder plexiformen Schicht der Netzhaut Zelle, die gewünscht wird, ist und 2) Immunhistochemie folgende elektrophysiologische Ableitung ist leichter, weil der intakten und flache Geometrie der Scheibe und die Faktoren in Artikel erwähnt (1) oben durchgeführt. Ein Protokoll für die Aufnahme leichte Anspraches der retinalen Nervenzellen in einem Agar-basierten Präparat wurde bereits in JoVE 2 veröffentlicht. Eine horizontale Netzhaut Scheibe Präparat, das eine Kombination von Agar und Filterpapier verwendeten Techniken war auch zuvor in JoVE 5 veröffentlicht. Wir empfehlen gerade diese Videos in Kombination mit unseren eigenen in die verschiedenen Techniken zu vergleichen.
Direkter Zugriff auf Band-Typ präsynaptischen in Wirbeltiere Netzhaut Scheiben ermöglicht es uns, die synaptische Übertragung an Band-Typ aktiven Zonen zu untersuchen. Es erlaubt uns auch direkt Studie der synaptischen Physiologie der Netzhaut Mikroschaltungen. Diese Technik ist besonders nützlich für gepaarte Aufnahmen von Pre-und Post-synaptische Signale, mit postsynaptischen Partnern, darunter hemmende Amakrinzellen und spiking Ganglienzellen 1, 16, 10. Gepaart Aufnahmen auf Band-Typ Synapsen zwischen Ratte Cochlea inneren Haarzellen und afferenten Dendriten sind möglich und wurden um 7 beschrieben worden. Calcium IMAGIng des Mb Bipolarzelle Terminals hat in akut dissoziierten Zellen 8 und in der Netzhaut Scheiben 17, sowie in Goldfisch Amakrinzellen 3 wurde durchgeführt. Jüngste Studien haben große Verbesserungen für die gezeigte in vivo und in vitro optogenetische Ansätze in transgenen Zebrafisch Retina 4. Künftige Ausrichtung wird wahrscheinlich beinhalten diese transgenen Techniken, zusammen mit elektrophysiologischen Methoden, die es uns ermöglichen, die Lücke zwischen In-vitro-slice-Aufnahmen und in-vivo-Bildgebung Brücke, was letztendlich zu Verhaltensstudien wird.
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Disclosures
Wir haben keine konkurrierenden Interessen offen zu legen.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Fred Rieke für seine freundliche Erklärung des Agar-embedded Netzhaut Scheibe Vorbereitung, wenn wir mit dem Protokoll in unserem Labor begonnen. Wir danken auch Lori Vaskalis für die Darstellung der schematischen Überblick und Drs. Veeramuthu Balakrishnan und Soyoun Cho für die hilfreichen Kommentare zum Text und Video. Diese Arbeit wurde durch einen NEI-NIH RO1 gewähren unterstützt, und wurde teilweise auch durch einen Korea Research Foundation Grant von der koreanischen Regierung finanziert unterstützt [KRF-2008 bis 357-E00032].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low gelling-temperature agar | Sigma-Aldrich | A0701 | Agarose type VII-A |
| Patch pipette | World Precision Instruments, Inc. | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
| Vertical puller | Narishige International | PP830 | |
| Dental wax | Cavex | ||
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| 45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Razor blade | Personna Medical Care | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
| Cylindrical tube | Fisher Scientific | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S or VT1200S | |
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX51WI | |
| 60x water-immersion objective | Olympus Corporation | LUMPlanFl | NA 0.90 |
| CCD camera | Sony Corporation | XC-75 | |
| Camera controller | Hamamatsu Corp. | C2400 | |
| Monitor | Sony Corporation | 13” black and white monitor | |
| Syringe filter | Nalge Nunc international | 0.2 μm | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MPC-200 | |
| Lock-in amplifier | HEKA Instruments | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
| Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
| Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffer solution | GIBCO, by Life Technologies | 70013 | |
| Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
| Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-25B | |
| Manuel vertical slicer | Narishige International | ST-20 | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
| Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |
References
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- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
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