يوصف أسلوب لتوليد شرائح عضوي النمط من الدماغ المتوسط E12.5 الفئران الجنينية. يمكن استخدام شريحة عضوي النمط الثقافات لمراقبة سلوك الخلايا العصبية الدوبامين العصبية الدماغ المتوسط أو غيرها من بطني.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الثقافات شريحة عضوي النمط من المخ الأوسط بطني الجنينية : نظام لدراسة التنمية متعلق بالخلايا العصبية الدوبامينية في المختبر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الفأر هو كائن نموذجا ممتازا لدراسة تطور الدماغ لدى الثدييات بسبب وفرة من البيانات الجزيئية والجينية. ومع ذلك ، فإن مخ الفأر النامية ليست مناسبة للتلاعب السهل والتصوير في الجسم الحي منذ جنين الفأر لا يمكن الوصول إليها وغير شفافة. ولذلك فإن الثقافات شريحة عضوي النمط من العقول الجنينية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة تطور الدماغ الفئران في المختبر. السابقين فيفو تلاعب أو استخدام الفئران المعدلة وراثيا يسمح تعديل الجينات بحيث يمكن تسمية مجموعات سكانية فرعية من الخلايا العصبية أو الدبقية مع البروتينات الفلورية. ويمكن بعد ذلك على سلوك الخلايا المسمى يراعى استخدام الوقت الفاصل بين التصوير. وقد الوقت الفاصل بين التصوير ناجحة بشكل خاص لدراسة سلوك الخلية التي تكمن وراء تطور قشرة الدماغ في المراحل الجنينية في وقت متأخر 1-2. الجنينية ثقافة شريحة عضوي النمط النظم في مناطق الدماغ خارج الدماغ المقدم establis هي أقلهد]. لذلك ، يقتصر ثروة من البيانات التصوير الوقت الفاصل بين الخلايا العصبية التي تصف هجرة الخلية إلى 3،4 الدماغ المقدم. ما زال من غير المعروف ما إذا كانت المبادئ اكتشفت للدماغ الظهرية ينطبق على مناطق الدماغ البطني. في الدماغ البطني ، ويتم تنظيم الخلايا العصبية في مجموعات الخلايا العصبية بدلا من الطبقات وغالبا ما يتعين عليها الخضوع لمسارات معقدة للوصول إلى المهاجرة موقفهم النهائي. الدماغ المتوسط في بطني ليست مجرد نظام نموذجا جيدا للتطور الدماغ البطني ، ولكن أيضا على السكان العصبية مثل الدوبامين العصبية التي هي ذات الصلة في عمليات المرض. في حين تم التحقيق فيها وظيفة وتنكس الخلايا العصبية الدوبامين بتفصيل كبير في تعليم الكبار والمخ من الشيخوخة ، لا يعرف إلا القليل عن سلوك هذه الخلايا العصبية خلال مرحلة التمايز والهجرة 5. نحن هنا وصف الجيل الثقافات شريحة من اليوم الجنينية (E) الدماغ المتوسط 12.5 الماوس البطني. هذه شريحة عبادةures ويحتمل أن تكون مناسبة لرصد الخلايا العصبية الدوبامين التنمية على مدى عدة ايام في المختبر. نسلط الضوء على الخطوات الحاسمة في توليد شرائح الدماغ في هذه المراحل المبكرة من التطور الجنيني ، ومناقشة الشروط اللازمة للحفاظ على النمو الطبيعي للخلايا العصبية الدوبامين في المختبر. نحن أيضا نتائج التجارب الوقت الحاضر من التصوير الفاصل. في هذه التجارب ، وصفت السلائف بطني الدماغ المتوسط (بما في ذلك السلائف الدوبامين) وذريتهم بطريقة الفسيفساء باستخدام لجنة المساواة العرقية / loxP مصير محرض نظام يستند تعيين 6.
البروتوكول
يتم تعديل أجزاء من هذا البروتوكول من دازا وآخرون ، 2007 7.
1. الاستعدادات
- يمكن أن يكون مستعدا قبل يوم واحد
- إعداد 1X كريبس العازلة (1.5 لتر) : كلوريد الصوديوم 126 ملم ، 2.5 ملم بوكل ، 1.2 ملي ناه 2 ص 4 : H 2 O ، 1.2 ملي MgCl 2 ، 2.5 مم CaCl 2 و 11 الجلوكوز مم ، 25 مم NaHCO 3 ؛ ضبط ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ثقافة شريحة عضوي النمط الطريقة المعروضة هنا يوفر النظام على المدى القصير في تحليل المختبر لتطوير الخلايا العصبية الدوبامين ومسارات هجرتها والإسقاط في الدماغ المتوسط في بطني الجنينية. وجدنا أن هناك عددا من الخطوات الحاسمة في البروتوكول الذي ينبغي أن حضر بعناية من أجل الحصول على شرائح التي تسمح للتطور الطبيعي للخلايا العصبية الدماغ المتوسط الدوبامين البطني. الخطوة الأكثر أهمية هو تشريح الدماغ الجنينية ، والذي يجب أن يكون على حد سواء بسرعة ودقة. على النقيض من جي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
شكر وتقدير
نشكر مارتين Emond Brachmann وإيزابيل لمساعدتهم في تأسيس ثقافة شريحة عضوي النمط النظام وولفغانغ هوبنر ليفيو وغابرييل Bodea لقراءة نقدية للمخطوطة. نود أن نشكر Costantini فرانك لمراسل R26 الفئران وكليف تابين للفئران CreER SHH. وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل على جائزة بحوث من وزارة العلوم والبحوث وشمال الراين وستفاليا (البرنامج للزور Förderung دير Rückkehr قصر wissenschaftlichen Spitzennachwuchses أسترالي Ausland ماركا).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
جدول محدد الكواشف والمعدات
| اسم الكاشف | شركة | فهرس العدد | تعليق (اختياري) |
|---|---|---|---|
| DMEM | سيغما الدريخ | D6429 | |
| الجلوكوز 30 ٪ | سيغما الدريخ | G7528 - 250 | |
| حصان المصل | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4،5 ز / L GLC. ، مع L - GLN ، نا البيرينيه ، NaHCO3) | سيغما الدريخ | D6429 - 500 | |
| البنسلين / الستبرتوميسين 100X | سيغما الدريخ | P4333 - 20 | |
| L - حمض الاسكوربيك | سيغما الدريخ | A4403 | تحضير وتخزين مخزون 200MM في -20 درجة مئوية |
| عالى النقاء LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| إدراج Millicel | ميليبور | PICMORG50 | |
| μ طبق 35 مم ، وانخفاض | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | جلالة 650V | |
| موس | بلانو محدودة | 121-6 | |
| Histoacryl الغراء | BRAU9381104 | براون Aesculap | |
| ملعقة مثقوبة ضياء قطره 15 ملم | أدوات العلوم غرامة | 10370 -18 | |
| ملقط 5 Dumoxel | أدوات العلوم غرامة | 11252-30 |
الأجسام المضادة المستخدمة لimmunostainings :
اسم الضد| شركة | فهرس العدد | تعليق (اختياري) | |
| أرنب المضادة للهيدروكسيلاز التيروزين | ميليبور | AB152 | التخفيف 1:500 |
| الماوس المضادة للهيدروكسيلاز التيروزين | ميليبور | MAB318 | التخفيف 1:500 |
| الماوس المضادة للBrdU | Pharmingen دينار بحريني | 555627 | التخفيف 1:200 |
| أرنب المضادة للالمشقوق caspase 3 | تكنولوجيا الخلية اشارة | 9661 | التخفيف 1:200 |
| حمار المضادة للأرنب مفتش اليكسا - 488 | Invitrogen | A21206 | التخفيف 1:500 |
| حمار مكافحة فأر مفتش - Cy3 | جاكسون ImmunoResearch | 715-165-150 | التخفيف 1:200 |
المراجع
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).
- Martini, F. J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
