Wir beschreiben eine Methode, um sensibilisiert postembryonalen Regulatoren der Protein-Expression und Lokalisation in identifizieren C elegans Mit Hilfe eines RNAi-basierter Genom-Bildschirm und einen integrierten Transgen, die eine funktionelle, fluoreszenzmarkierten Protein exprimiert.
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Methodenartikel
RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
C. elegans hat sich als wertvolles Modellsystem für die Entdeckung und funktionale Charakterisierung zahlreicher Gene und Genwege1 erwiesen. Fortschrittlichere Werkzeuge und Ressourcen für Untersuchungen an diesem System erleichtern die weitere Entdeckung von Genen mit subtileren Phänotypen oder Funktionen.
Hier stellen wir einen verallgemeinerten Protokollansatz vor, den wir angepasst haben, um C. elegans-Gene mit postembryonalen Phänotypen von Interesse mittels RNAi2 zu identifizieren. Dieses Verfahren lässt sich leicht anpassen, um den gewünschten Phänotyp entweder mit Licht- oder Fluoreszenzoptik am Stereomikroskop oder am Auflichtmikroskop zu analysieren. Das Screening-Protokoll nutzt die physikalischen Eigenschaften des Organismus sowie molekulare Werkzeuge, die die C. elegans-Forschungsgemeinschaft entwickelt hat. Als Beispiel zeigen wir den Einsatz eines integrierten Transgens, das ein fluoreszierendes Produkt exprimiert, in einem RNAi-Screen, um Gene zu identifizieren, die für die normale Lokalisation dieses Produkts in späten Larvenstadien und adulten Tieren erforderlich sind. Zunächst verwendeten wir eine kommerziell verfügbare genomische RNAi-Bibliothek mit vollständigen cDNA-Einschüben. Diese Bibliothek ermöglicht die schnelle Identifizierung mehrerer Kandidaten durch RNAi-vermittelte Reduktion des jeweiligen Genprodukts. Zweitens erzeugten wir ein integriertes Transgen, das unser fluoreszenzmarkiertes Protein von Interesse in einem RNAi-empfindlichen Hintergrund exprimiert. Drittens erlaubt dieser Screen durch Exposition der geschlüpften Tiere gegenüber RNAi die Identifizierung von Genprodukten, die eine lebenswichtige embryonale Funktion haben, die andernfalls eine postembryonale Rolle bei der Regulation des Proteins von Interesse überdecken würde. Schließlich verwendet dieser Screen ein Auflichtmikroskop, das für die Auflösung einzelner Zellen ausgestattet ist.
Protokoll
1. Screening-Stamm Bau
Die sorgfältige Gestaltung des Screening-Stamm ist entscheidend für den Erfolg des Bildschirms und wurde an anderer Stelle 3 beschrieben. Für einige Forscher, ist mit einer Belastung, die ein sichtbares Produkt drückt aus einem Transgen für das Experiment benötigt. Viele Stämme mit integrierten Transgenen sind bei den einzelnen Forschern oder CGC. Wenn eine transgene Sorte für den Bildschirm erforderlich ist, aber nicht verfügbar ist, dann kann es unter Verwendung eines veröffentlichten Verfahren wie Bombardement 4, UV / TMP 5 oder 6 Mos Transposon-Insertion werden. Um unser....
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Diskussion
Die RNAi-Screening hier vorgestellte Methode ermöglicht eine schnelle und sensitive Analyse von Gen-Produkten für einen normalen (oder transgene) postembryonalen Phänotyp erforderlich. Das gezeigte Beispiel ist ein Bildschirm für die Gene in der subzellulären Lokalisation eines fluoreszenzmarkierten Proteins beteiligt. Allerdings ist dieses Protokoll modifiziert werden, um Gene, die anderen postembryonalen Phänotypen von Interesse zu identifizieren.
Diese Methode nutzt eine Kandidatengen-Ans.......
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Offenlegungen
Wir haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren danken Herrn Dr. Rick Padgett (Waksman Institut, Rutgers University, NJ) für das Geschenk des DBL-1 cDNA und Dr. Christopher Rongo (Waksman Institut, Rutgers University, NJ) für eine Injektion Marker danken. Dr. Barth Grants Labor durchgeführt, die das Gen für die Bombardierung Pistole mit geringer Kopienzahl Integration des GFP-markierten DBL-1-Konstrukt. Die René Garcia Labor leistete technische Hilfe bei der Erstellung der texIs100. Die René Garcia, Robyn Lints und Hongmin Qin Laboratorien zur Verfügung gestellt produktive Beratung. Diese Arbeit wurde vom Start-up-Mitteln aus dem TAMHSC Department of Molecular and Cellular Me....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| NGM-Agar | Nematoden Wachstumsmedium | IPM Scientific, Inc | Kann nach der NGM-Agar-Protokoll 25 vorbereitet werden |
| M9 Medium | 22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 86mm NaCl, 1 mM MgSO 4 | 26 | |
| Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in Wasser für NGM Platten. 4% in Wasser für Objektträger-Pads (Autoklav zunächst Mikrowelle und danach zu schmelzen). |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson - Difco CP | 211677 | 0,25% |
| IPTG | Research Products International Corp | I56000-5.0 | 1 mM Endkonzentration |
| Carbenicillin | Research Products International Corp | C46000-5.0 | 50 ug / ml Gebrauchsverdünnung |
| LB-Nährlösung Lennox | Becton Dickinson - Difco CP | 240230 | 20 g / Liter |
| Tetracyclin | Sigma | 268054 | 12,5 pg / ml Gebrauchsverdünnung |
| Natriumhypochlorit | Jede Marke | 5% Haushaltsbleiche | Verwenden Sie frische Bleiche. |
| Natriumhydroxid | Beliebige Marke | CAS 1310-73-2 | 5 N Lager |
| M9-Medium | Wormlab Rezept-Buch | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab | 26 |
| Levamisol | Sigma | 31742 | 100 pM - 1 mM Gebrauchsverdünnung |
| Natriumazid | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 Gebrauchsverdünnung |
| 24-Well-Platte | Greiner Bio-One | 662160 | VWR Distributor |
| Objektträger | Jede Marke | 75 x 25 x 1 mm | |
| Mikroskop Deckgläser | Jede Marke | 22 x 22 mm No.1.5 | Verwenden Sie die Stärke durch das Mikroskop Hersteller empfohlen wird. |
| zusammengesetztes Mikroskop | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Verwendung Ziele und Filter können die Bedürfnisse des Experiments lassen. |
| Medien Pumpe | Manostat Varistaltic Pumpe | Kate Modell # 72-620-000 | Verwenden Sie Schläuche und die passenden Einstellungen für die Maschine |
Referenzen
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
