使用商用凝胶盒重复制备和电泳蛋白凝胶

摘要

本实验方案展示了如何通过重复使用Invitrogen Nupage Novex微型凝胶盒以及在家居装修商店购买的廉价材料，同时制备多块蛋白质凝胶。这种经济且高效的流程还包括将凝胶在4°C下保存数周的方法。通过重复使用商业凝胶中的塑料凝胶盒，频繁进行蛋白质凝胶电泳的实验室可显著节省成本，并有助于环境保护。

摘要

采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析对蛋白质进行检测是生物化学与分子生物学研究人员常用的技术^1-4对于每天进行蛋白质分析的实验室而言， commercially available polyacrylamide gels 的成本˜$10/胶）长期累积也是一笔可观的开支。为降低此项成本，一些研究人员选择自行制备聚丙烯酰胺凝胶。传统的凝胶制备方法通常需要使用专用设备和玻璃胶板，而这些材料价格较高，且限制了同时制备和储存多块凝胶用于后续实验的能力。此外，在清洗或灌胶过程中操作玻璃板时可能发生意外破碎，造成安全隐患，因而可能不适用于本科生实验课程。本实验方案展示了如何利用回收的Invitrogen Nupage Novex微型胶盒以及从家装商店购买的低成本材料，同时制备多块蛋白凝胶。该经济高效的方法还包括在4℃条件下储存凝胶的步骤°几周后。通过重复使用市售凝胶中的塑料胶盒，频繁进行蛋白质凝胶电泳的实验室可以显著节省成本并减少环境污染。此外，塑料胶盒具有极强的抗破损性，非常适合本科教学实验室使用。

方案

1. 准备受盒

1. 清洗已使用过的 Invitrogen Nupage Novex mini胶盒或其它商用mini胶盒的前板和后板。
2. 根据制造商说明，配制约1–3 ml的塑料环氧树脂并充分混合。
3. 将环氧树脂涂于前板内侧边缘，该位置为胶盒组装时前后板相互接触的区域。
4. 在组装胶盒时，将一片滤纸或硬纸板从后板底部的狭缝中插入，以防止多余的环氧树脂封住开口；待前后板组装完成后立即取出滤纸。
5. 在胶盒边缘夹上文件夹夹以确保紧密密封，并将胶盒静置过夜，使环氧树脂完全固化。
6. 用绝缘胶带密封后板底部的狭缝。

2. 灌制分离胶

1. 取一个 125 ml 的侧臂烧瓶，加入以下成分：2.25 ml 的 4X Tris-碱分离胶缓冲液（pH 8.70）、3.50 ml 的 30.8% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液、3.25 ml 的 I 型试剂级水（IRG-H₂O），总体积为 9 ml。
2. 将烧瓶的侧臂连接至真空装置，并在烧瓶口倒置一个塞子，对溶液抽气 10 分钟以去除溶解氧。
3. 将 9 ml 脱气后的溶液转移至一个 50 ml 的一次性聚丙烯离心管中，加入 30 μl 的 10% 过硫酸铵（APS）和 6 μl 的 N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED），轻轻旋转混匀，避免引入气泡。

讨论

蛋白质凝胶电泳是大多数分子生物学实验室不可或缺的一种方法。市面上可购买的迷你凝胶系统提供了高度的便利性，但成本较高。本文介绍如何重复使用一种常见品牌的商用迷你凝胶盒（minigel cassette）。该方法保留了预制凝胶来源的便利性，同时成本仅为商用迷你凝胶的一小部分。此操作中的关键步骤是在加入未聚合的丙烯酰胺之前，使用适量的环氧树脂完全密封凝胶盒，以防止泄漏。仅使用适用于塑料的环氧树脂，并按照制造商说明书的要求留出足够时间使环氧树脂充分聚合。为了进一步提高便利性，可在灌制凝胶前预先密封多个凝胶盒并储存备用。在灌制分离胶时，务必为浓缩胶预留足够的空间，通常应比用于形成加样孔的梳子高度多出约0.5 cm。在分离胶聚合过程中，应将凝胶保持直立状态，以便缓冲液饱和的1-丁醇在分离胶顶部形成平整的界面。如果凝胶在30分钟内未能完成聚合，可适当增加10%过硫酸铵（APS）和TEMED的用量。电泳结束后，需小心地打破环氧树脂密封，以避免撕裂薄而脆弱的凝胶。本文所述的重复使用商用凝胶盒的方法，可显著降低频繁进行SDS-PAGE实验所产生的成本。同一凝胶盒可重复使用多年，我们尚未发现重复使用会降低其可用性。此外，可预先制备多块凝胶，并将其储存在含有少.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm)	Invitrogen	NC2010	提供 2、5、10、12、15 和 2D 孔规格
塑料环氧树脂	Loctite	108771
绝缘胶带	Scotch Co.
125 mL 带侧臂烧瓶	Pyrex	5360
4X Tris-Base 分离胶缓冲液			1.5 M Tris-Base，pH 8.7
丙烯酰胺	Fisher Scientific	01065-500
双丙烯酰胺	MP Biomedicals	800173
30.8% 丙烯酰胺溶液			丙烯酰胺:双丙烯酰胺 = 30:0.8，溶于 IRG-H2O
10% APS	Fisher Scientific	BP179-25	0.1 g 过硫酸铵溶于 1 ml IRG-H2O，使用前立即配制
TEMED	Acros Organics	138450500
用 1X 分离胶缓冲液饱和的 1-丁醇			1-丁醇:1X 分离胶缓冲液 = 5:2
4X Tris-Base 浓缩胶缓冲液			1.5 M Tris-Base，pH 6.8
凝胶梳	Invitrogen	NC3015	15 孔，1.0 mm 厚度
脉冲封口机	TEW Electric Heating Equipment
可热封袋	Kapak/Scotchpak		1 品脱尺寸 (6.5" x 8")
凝胶储存缓冲液			含 0.1% 叠氮化钠的 1X 浓缩胶缓冲液
Novex SDS Tris-甘氨酸上样缓冲液 (2X)	Invitrogen	LC2676
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
10X Tris-甘氨酸电泳缓冲液	Invitrogen	LC2675	1L 10X 储存液：29.0 g Tris-Base，144.0 g 甘氨酸，10.0 g SDS
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001
凝胶切刀	Invitrogen	EI9010
SimplyBlue 安全染色液	Invitrogen	LC6065