本方案介绍了一种用于器官培养的牛尾部椎间盘采集技术 体外 器官培养
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摘要
摘要
椎间盘（IVD）是脊柱中连接椎体与椎体的关节，其功能是传递脊柱载荷并为脊柱提供灵活性。椎间盘由三个部分组成：最内层的髓核（NP），被纤维环（AF）所包裹，以及两侧连接髓核和纤维环与椎体的软骨终板。由退行性椎间盘疾病（DDD）和椎间盘突出可能引起的盘源性疼痛，已被确认为现代社会中的一个主要问题。为了研究椎间盘退变的可能机制，含有活椎间盘细胞的体外器官培养系统具有很高的吸引力。完整牛尾部尾椎椎间盘的体外培养已发展为一种相关模型系统，可在良好控制的生理和力学环境中研究其力学-生物学特性。牛尾椎间盘相对容易大量获取，并且在细胞密度、细胞群体和尺寸方面与人类腰椎椎间盘非常相似。然而，以往保留软骨终板和骨性终板的牛尾部椎间盘获取技术在培养1-2天后即失败，原因是凝固的血液明显阻塞了营养通路。椎间盘是人体最大的无血管器官，因此髓核细胞的营养完全依赖于来自相邻椎体毛细血管芽的扩散。终板表面存在的骨碎片和凝血块可能阻碍营养物质向椎间盘中心的扩散，从而影响细胞活力。我们团队建立了一种相对快速的“破取”技术，可从尾部取出椎间盘，且污染风险较低。我们能够利用外科喷射灌洗系统对新鲜切割的骨性终板表面进行通透处理，有效清除血凝块和切割残留物，从而高效地重新开放营养物质向椎间盘中心扩散的通路。在培养前必须避免并去除椎体两侧的生长板。在本视频中，我们概述了制备过程中的关键步骤，并展示了在自由肿胀培养条件下维持14天高细胞活力的成功器官培养的关键技术。若能通过机械加载生物反应器维持适当的力学环境，培养时间还可进一步延长。本研究所展示的技术也可推广至其他动物物种，如猪、羊和兔的尾部及腰椎椎间盘分离。
方案
1. 椎间盘的采集
- 从当地屠宰场获取整条牛尾，若可能应选择无皮肤的牛尾，因为皮肤的存在会增加污染的风险（图2）。
- 准备一个大型砧板，并在砧板上设置无菌操作台及无菌器械（图2）。
- 在无菌超净工作台内，将用含55 mM柠檬酸钠的0.9%氯化钠溶液浸湿的无菌纱布准备好，并放入6孔板的每个孔中。
- 准备一个盆，用自来水将1:100稀释的聚维酮碘溶液（Betadine）配制好。
- 将整条牛尾浸入含有1%聚维酮碘溶液的盆中，持续5分钟。
- 用无菌纱布快速擦干牛尾，并将其放置在无菌操作台上。
- 使用#22号手术刀片小心地去除尾部周围的肌肉组织。
- 切除不需要的尾部部分，通常为尾部两端，因其包含相对较大或过小的椎间盘（IVD）（图3）。
- 使用#10号手术刀片进一步修整椎间盘周围的肌肉和肌腱，注意不要切到椎间盘的外层纤维环。
- 用外科皮肤标记笔标记椎间盘的腹侧（此步骤为可选，有助于在我们的生物反应器中确定轴向旋转的中心）。
- 轻轻活动尾部以定位椎间盘与椎骨的连接点，用手术刀片的钝边触感判断椎间盘与骨组织之间的边界。分离切口应位于距椎间盘向椎骨方向1–2 mm处。将定制的工业刀片夹具置于分离位置（图4）。
- 通过敲击定制的工业刀片夹具顶部，分离椎间盘与椎骨（图3）。
- 在椎间盘-椎骨连接的另一侧重复上述操作。....
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讨论
成功进行器官培养的第一步是确保外植体不被污染。在开始操作前，应先将尾部去皮。任何带入无菌实验室的动物毛发都可能带来污染风险。牛尾应尽可能新鲜（这会影响初始细胞的活力）。此外，建议使用碘伏清洗步骤，以进一步降低污染风险。分离椎间盘与椎体时，可不使用自制刀片夹具和锤子，而改用组织学带锯（切割时应使用PBS或林格氏液冷却金刚石锯片）。注意，带锯、样品夹持器和切割刀片均须保持无菌。此处演示的技术不仅限于牛尾椎间盘的分离，还可推广至其他动物物种，如猪、羊和兔的尾部甚至腰椎椎间盘的分离。在脊突存在的区域进行椎间盘采集时，必须首先完全去除所有突起结构。
图9中给出的细胞活力数据是在自由膨胀条件下培养长达21天后收集的，可作为参考。该方法在自由膨胀条件下可维持细胞活力达14天。21天时细胞活力下降可能是由于缺乏机械负荷，而机械负荷已被证明对促进营养物质通过终板扩散以及维持椎间盘细胞活力具有重要作用3。在静水压压缩和/或额外的昼夜负荷条件下，细胞活力很可能会更高8-10。
作为一种替代方案，可通过使用.......
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致谢
本项目由瑞士国家科学基金会（SNF # 310030-127586/1）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 来自当地屠宰场的新鲜牛尾椎间盘组织（理想情况下在动物死亡后数小时内获取，且不含皮肤）。 | |||
| Pulsavac Plus AC 系统 | Zimmer 公司，瑞士 | 00-5150-486-01 | 使用髋部喷头并连接交流电源（配备8节AA电池盒的型号）时性能最佳–但效果较差且不够方便 |
| 高容量风扇喷雾头配防溅罩，12.7 cm 长度 | Zimmer inc.，瑞士 | 00-5150-175-00 | 有多种喷头可供选择，我们已成功测试了这一款 |
| 22号和10号手术刀片 | Swann-Morton | #10: 0201 #22: 0208 | |
| 手术刀片持柄 #3 和 #4 | 德国豪斯曼 | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 | |
| Lutz 工业刀片 | 吕茨，德国 | 1022.0884 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Invitrogen | 10010-023 | |
| 杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基） | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11960-044 | |
| 乳酸林格液’不含葡萄糖的溶液 | 比赫塞尔，瑞士 | 133 0002 | |
| 6孔多孔板 | Techno Plastic Products | 92006 | |
| 聚维酮碘溶液 | Mundipharma，瑞士 | 10055025 | |
| 外科皮肤标记笔 | Porex Surgical，瑞士 | 9560 | |
| 大型切菜板 | 任何品牌均可 |
参考文献
- Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).
- Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D.
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