细胞内复性实验

摘要

本方案描述了一种用于测量热激后细胞内蛋白质重折叠的方法。该方法可用于研究分子伴侣及其辅助因子，或能够影响其活性的化合物等折叠酶类。通过检测萤火虫荧光素酶的活性作为报告信号，以衡量分子伴侣的重折叠活性。

摘要

本方案描述了一种在基于细胞的系统中测量分子伴侣酶活性以及具有抑制/激活活性化合物可能影响的方法。分子伴侣是参与调控蛋白质折叠的蛋白质¹，在应对热休克²、营养缺乏以及化学物质/毒素暴露等应激损伤时，对促进细胞存活具有关键作用³。因此，分子伴侣被发现参与肿瘤发生、癌细胞的化疗耐药性⁴以及神经退行性病变⁵等过程。设计能够抑制或激活这些酶活性的小分子，因此成为癌症治疗⁷和神经退行性疾病⁹中最受关注的策略之一。此处描述的检测方法可用于测量特定分子伴侣的重折叠活性，并研究化合物对其活性的影响。在该方法中，将待研究的分子伴侣基因与编码萤火虫荧光素酶基因的表达载体共同转染细胞。已有文献报道，变性的萤火虫荧光素酶可被分子伴侣重新折叠^10,11。作为转染归一化对照，同时转染编码海肾荧光素酶基因的载体。本方案中所有转染均使用X-treme Gene ¹¹（Roche）在HEK-293细胞中进行。第一步，通过环己酰亚胺处理抑制蛋白质合成。随后，在45°C下进行30分钟热休克以诱导蛋白质去折叠。在37°C恢复期间，蛋白质重新折叠为具有活性的构象，以萤火虫荧光素酶的活性作为检测读数：产生的光信号越强，表明越多蛋白质恢复至原始构象。未进行热休克的细胞设为参照（重折叠荧光素酶为100%）。

方案

1. 接种细胞

1. 开始前，将培养基、1× PBS 和胰蛋白酶在 37°C 水浴中预热。
2. 从培养箱中取出细胞，吸除培养基。
3. 轻柔地向细胞中加入 5 mL 1× PBS 进行洗涤。
4. 吸除 1× PBS，加入含 0.025% EDTA 的胰蛋白酶 1 mL。
5. 轻柔地旋转培养皿，使胰蛋白酶均匀分布。
6. 将细胞置于 37°C 培养箱中孵育 5–10 分钟（根据细胞类型而定），期间可轻摇培养皿，观察细胞是否已脱落。
7. 用 10–20 mL 培养基重悬细胞，并收集至 50 mL 离心管中。
8. 使用 Beckman 细胞计数仪对细胞进行计数，细胞数量应足以确保接种后融合度达到约 60–70%。
9. 接种细胞，并静置培养 6–8 小时使其贴壁。

2. 转染

1. 转染前，将一份无血清培养基在37 °C水浴中预热。
2. 将X-treme Gene 9恢复至室温。
3. 用移液器将无血清培养基分别加入两个离心管中（1个管=1次转染）。
4. 将X-treme Gene 9加入无血清培养基中，注意枪头不要接触离心管的管壁，室温孵育5分钟。在此期间准备两份DNA混合物：在一个管中混合海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶和空载体对照的质粒，在....

讨论

本研究介绍了一种用于测量分子伴侣胞内重折叠活性的实验方案。整个检测可在3至4天内完成，具体流程如图1所示。

萤光素酶和海肾萤光素酶产生的光信号具有良好的稳健性和线性，为本实验方案的可重复性提供了坚实基础。

该实验的关键步骤是选择一种高效的转染试剂，以确保分子伴侣和萤火虫荧光素酶的过表达。报告基因也可通过其他方法递送，例如腺病毒转染¹²或电穿孔。另一种选择是使用转基因细胞系，其中分子伴侣的表达可通过化学诱导（例如四环素响应启动子）¹³，而萤火虫荧光素酶基因则稳定转染。这一系列可选方案使得该检测方法可应用于多种细胞系，包括原代细胞。

此外，如果某种细胞系对环己酰亚胺处理特别敏感，可使用可阻遏/可诱导系统来终止萤火虫荧光素酶的蛋白质翻译。

由于不同分子伴侣的重折叠活性可能存在差异，因此应始终对转染的分子伴侣用量进行滴定。一旦在特定细胞系.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Perkin Elmer 公司的 Luminometer “1420 Luminescence Counter” Vector Light′ 被使用
荧光计程序：
Renilla：泵 1，100 μ注射
反应缓冲液：Pump1，70 μ注射
荧光素：Pump2, 30μ注射
对于缓冲液，使用双蒸水配制以下贮存液：
- 1 M MgSO₄4 ：246.48 g MgSO₄4*7H2O 在 1 升中 - 0.5 M EGTA：190.18克EGTA定容至1升 - 1 M KH2PO4：136.09 g KH2PO4 在1升中 - 1 M K2HPO4：228.23 g K2HPO4*3H2O 在 1 升中 - 5M NaCl：292.2 g NaCl 溶于 1 升水中 - 0.5 M EDTA：186,12 g EDTA*2H₂O2O 在 1 升中
GLY-GLY缓冲液：
- 25 mM 甘氨酰甘氨酸 - 15 mM MgSO₄4 - 4 mM EGTA
每升使用 3.3 g 甘氨酰甘氨酸、15 ml 1 M MgSO4 溶液和 8 ml 0.5 M EGTA 溶液。溶于水，调节 pH 至 7.8，定容至 1 升。
海肾荧光素酶反应缓冲液–腔肠素缓冲液：
- 13.4 mM KH2PO4 - 86.6 mM KH2PO4 - 0.5 M NaCl - 1 mM EDTA
1升溶液使用13.4毫升1M KH2PO4 溶液，86.6 ml 的 1M K2HPO4 溶液，100 ml 的 5 M NaCl 溶液和 2 ml 的 0.5 M EDTA 溶液。
DMEM （1× 丹尼尔·马尔科姆·伊格尔培养基）	GIBCO	41966029
优等胎牛血清	PAA	A15-151
X-treme Gene 9 DNA转染试剂	罗氏	06365809001
PBS 1× 磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）	GIBCO	14190-094
MOPS 3-(N-吗啉代)丙磺酸	SIGMA-ALDRICH	M1254
环己酰亚胺	SIGMA-ALDRICH	C7698
5× 被动裂解缓冲液	普洛麦格	E194A
甘氨酰甘氨酸 EGTA MgSO₄4 (MgSO₄)47H2O)	SIGMA-ALDRICH Roth Roth	G7278 3054.2 P027.1
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) 氯化钠 EDTA	Roth Roth Roth Roth	3904.1 6878.2 3957.1 8043.1
荧光素（萤火虫）	Biosynth	L8200
C–腔肠素	Biosynth	C7000
DTT 二硫苏糖醇	Roth	6908.2
ATP （三磷酸腺苷）	罗氏	10519987001