Questa dettagli del protocollo un metodo per la misura quantitativa della traslocazione peptidica in grandi vescicole lipidiche unilamellari. Questo metodo fornisce anche informazioni circa la velocità di traslocazione della membrana e può essere utilizzato per identificare i peptidi che in modo efficiente e spontaneamente croce doppi strati lipidici.
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Articolo metodologico
Misurazione Traslocazione Peptide in grandi vescicole unilamellari
In questo articolo
Sommario
Abstract
C'è un interesse attivo nel peptidi che attraversano facilmente le membrane cellulari senza l'ausilio di recettori di membrana delle cellule 1. Molti di questi sono indicati come cella penetrante peptidi, che sono spesso noti per il loro potenziale come vettori di consegna della droga 1-3. Inoltre, c'è un interesse crescente in peptidi antimicrobici che operano attraverso meccanismi di membrana non-litica 4,5, in particolare quelli che attraversano le membrane batteriche senza causare la lisi cellulare e uccidere le cellule interferendo con i processi intracellulari 6,7. In realtà, gli autori hanno sempre sottolineato il rapporto tra peptidi cellula-penetrante e antimicrobico 1,8. Una solida conoscenza del processo di traslocazione della membrana e il rapporto tra struttura peptidica e la sua capacità di traslocare devono essere efficaci, i test riproducibili per traslocazione. Diversi gruppi hanno proposto metodi per misurare la traslocazione in unilamel grandeLAR vescicole lipidiche (luvs) 9-13. Luvs servire come modelli utili per le membrane delle cellule batteriche e eucariotiche e sono frequentemente utilizzati in studi peptide fluorescente 14,15. Qui, descriviamo la nostra applicazione del primo metodo sviluppato da Matsuzaki e collaboratori di prendere in considerazione peptidi antimicrobici, come magainin e buforin II 16,17. Oltre a fornire il nostro protocollo per questo metodo, abbiamo anche presentare un approccio diretto per l'analisi dei dati che quantifica la capacità traslocazione da questo test. I vantaggi di questo test traslocazione rispetto ad altri che ha il potenziale per fornire informazioni circa la velocità di traslocazione della membrana e non richiede l'aggiunta di un'etichetta fluorescente, che possono alterare le proprietà del peptide 18, di triptofano contenenti peptidi. In breve, la capacità di traslocazione in vescicole lipidiche è misurata in funzione della Foster Resonance Energy Transfer (FRET) tra i residui di triptofano nativi e dansyl fosfatidiletanolamina quando le proteine sono associate con l'esterno LUV membrana (Figura 1). Cell-penetrante peptidi sono spaccati in quanto incontro tripsina disinibita incapsulato con il luvs, porta alla dissociazione dal LUV membrana e un calo del segnale FRET. Il calo FRET segnale osservato per un peptide translocating è significativamente maggiore di quello osservato per il peptide stesso quando il luvs contengono sia tripsina e inibitore della tripsina, o quando un peptide che non spontaneamente attraversare le membrane lipidiche è esposto a tripsina contenenti luvs. Questo cambiamento di fluorescenza fornisce una quantificazione diretta della traslocazione del peptide nel tempo.
Protocollo
1. Preparazione di grandi vescicole lipidiche unilamellari (luvs)
- Preparare luvs a servire come membrana cellulare imita per il dosaggio 19.
- Mix fosfatidilcolina (POPC, 760,10 g / mol), fosfatidilglicerolo (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonil fosfatidiletanolammina (DNS-PAPA, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) disciolto in cloroformio in un 50 : rapporto 45:5. Come ogni test richiede la gestione separata di luvs sia sperimentale e di controllo, due fiale torta dei lipidi deve essere preparato. 0,376 mg di lipidi totali (0,188 mg POPC, POPG 0,169 mg e 0,019 mg di DNS-PAPA) è solitamente sufficiente a rendere....
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Discussione
Il protocollo presentato qui può essere utilizzato per valutare la variazione relativa della concentrazione di peptidi all'interno e all'esterno delle vescicole lipidiche. Questi cambiamenti sono legati alla capacità di traslocazione. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare cellule penetrante peptidi con potenziale come vettori di consegna della droga. Come interesse nella cella-penetrante peptidi cresce, sarà interessante vedere come i metodi che misurano direttamente l'evento traslocazione.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Eleonora Fleming e Jessica Chen per le discussioni utili. Il finanziamento è stato fornito da Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID-NIH) e un Premio R15AI079685 Research Corporation Cottrell Award Science College. Sostegno degli studenti sono state fornite dal Howard Hughes Medical Institute e del fondo Staley.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| 16:00-18:01 PG | Lipidi Avanti Polar | 840457C | |
| 01:18 Dansyl PE | Lipidi Avanti Polar | 810330C | |
| 16:00-18:01 PC | Lipidi Avanti Polar | 850457C | |
| Suini tripsina | Sigma | T-0303 | |
| Bowman-Birk tripsina / chimotripsina inibitore | Sigma | T-9777 | |
| Mini-estrusore | Lipidi Avanti Polar | 610000 | |
| Ammonio molibdato (para) | Alfa Aesar | 10811 | |
| Acido L-ascorbico | Sigma | A1417 | |
| Perossido di idrogeno, 30% di soluzione | Mallinckrodt prodotti chimici | 5240-05 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| NaCl | Sigma | S-9625 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| NaH 2 PO 4 | Sigma | S-0751 |
Riferimenti
- Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they? Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
- Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug....
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Ristampe e permessi
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