Organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में Purkinje सेल वृक्ष के समान आकृति विज्ञान के विश्लेषण
Summary
हम एक प्रोटोकॉल है कि देखने है और मात्रात्मक गधे के लिए व्यक्तिगत Purkinje organotypic अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों में विकसित कोशिकाओं के वृक्ष के समान पेड़ की आकारिकी परमिट उपस्थित थे. यह प्रोटोकॉल का Purkinje सेल वृक्ष के समान विकास के तंत्र पर अध्ययन को बढ़ावा देने का इरादा है.
Abstract
Purkinje कोशिकाओं वृक्ष के समान विकास के अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल की व्यवस्था कर रहे हैं, क्योंकि वे एक प्रभावशाली वृक्ष के समान पेड़ है जो बाण के समान विमान में कड़ाई से उन्मुख है और 3 छोटे कृन्तकों में प्रसवोत्तर अवधि में ज्यादातर विकसित है. इसके अलावा, कई एंटीबॉडी उपलब्ध हैं जो चुनिंदा और अधिकता सभी प्रक्रियाओं सहित लेबल Purkinje विरोधी Calbindin D28K साथ कोशिकाओं सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है. जीवित कोशिकाओं में dendrites के देखने के लिए, चुनिंदा EGFP Purkinje 11 कोशिकाओं में व्यक्त चूहों जैक्सन प्रयोगशालाओं के माध्यम से उपलब्ध हैं. Organotypic अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों कोशिकाओं Purkinje सेल वृक्ष के समान विकास के लिए आसान प्रयोगात्मक हेरफेर की अनुमति Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ के वृक्ष के समान विस्तार की सबसे क्योंकि वास्तव में संस्कृति 4 अवधि के दौरान जगह ले जा रहा है. हम यहाँ Purkinje कोशिकाओं के वृक्ष के समान आकारिकी organotypi में हो देखने और विश्लेषण करने के लिए एक छोटी, विश्वसनीय और आसान प्रोटोकॉल उपस्थितग अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों. कई प्रयोजनों के लिए, Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ के एक मात्रात्मक मूल्यांकन वांछनीय है. हम यहाँ दो मापदंडों, वृक्ष के समान पेड़ के आकार और शाखा बिन्दु संख्या है, जो तेजी से और आसानी से विरोधी calbindin दाग अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों से निर्धारित किया जा सकता है पर ध्यान केंद्रित. इन दो मापदंडों Purkinje सेल वृक्ष के समान पेड़ के परिवर्तन की एक विश्वसनीय और संवेदनशील उपाय उपज. प्रोटीन kinase सी (PKC) उत्प्रेरक PMA और metabotropic ग्लूटामेट 1 रिसेप्टर (mGluR1) हम दिखाना है कि वृक्ष के समान विकास में मतभेद visualized और मात्रात्मक मूल्यांकन कर रहे हैं के साथ उपचार के उदाहरण का उपयोग करना. एक व्यापक वृक्ष के समान पेड़, चयनात्मक और तीव्र immunostaining विधियों, organotypic टुकड़ा संस्कृतियों जो Purkinje सेल विशिष्ट EGFP अभिव्यक्ति के साथ वृक्ष के समान विकास और एक माउस मॉडल की अवधि को कवर Purkinje वृक्ष के समान के तंत्र का खुलासा करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली कोशिकाओं को बनाने की उपस्थिति के संयोजन विकास.
Protocol
Discussion
तरीके यहाँ प्रस्तुत organotypic अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों में Purkinje सेल वृक्ष के समान विकास का अध्ययन और मात्रात्मक वृक्ष के समान पेड़ आकार और वृक्ष के समान शाखा अंक की संख्या को मापने के द्वारा Purkinje सेल व?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम बास्ले विश्वविद्यालय, बायोमेडिसिन विभाग, और स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (31003A 116,624) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tissue culture Inserts | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal Medum Eagle | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Horse serum | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS)-3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Rabbit anti-calbindin D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Rabbit anti-GFP | Abcam | Ab290 |
References
- Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
- Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation. J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).
- Kapfhammer, J. P. Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells. Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).
- Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. Cerebellar slice cultures. Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).
- Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death. J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).
- Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-κB signaling. Neuron. 68, 45-60 (2010).
- Metzger, F., Kapfhammer, J. P. Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures. Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).
- Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice. Neuroscience. 110, 675-689 (2002).
- Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures. Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- Weyer, A., Schilling, K. Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum. J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).
