De verwoesting van de graangewassen door zaad-infecterende schimmels heeft ertoe geleid dat tal van onderzoeksinspanningen om beter te begrijpen plant-pathogeen interacties. Om zaad-schimmel interacties in een laboratorium te bestuderen, ontwikkelden we een robuuste methode voor de kwantificering van de schimmel reproductie, biomassa en verontreiniging met mycotoxinen met behulp van kernel bioassays.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantificering van schimmelkolonisatie, Sporogenesis, en de productie van mycotoxinen Met behulp van Kernel Bioassays
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het rotten van granen door zaad-infecteren schimmels vormt een van de grootste economische uitdagingen voor graanproductie de hele wereld, niet aan ernstige risico's te vermelden mens en dier. Onder de productie van graan, maïs is waarschijnlijk de meest getroffen gewas, als gevolg van pathogenen geïnduceerde verliezen in graan integriteit en de mycotoxine zaad besmetting. De twee meest voorkomende en problematisch mycotoxinen voor maïs telers en levensmiddelen en diervoeders processors zijn aflatoxine en fumonisine, geproduceerd door Aspergillus flavus en Fusarium verticillioides, respectievelijk.
Recente studies in de moleculaire plant-pathogeen interacties hebben aangetoond belofte in het begrijpen van specifieke mechanismen in verband gebracht met plantaardige reacties op schimmelinfecties en verontreiniging met mycotoxinen 1,2,3,4,5,6. Omdat veel labs gebruikt kernel assays van planten-pathogeen interacties te bestuderen, is er behoefte aan een gestandaardiseerde methode voor het kwantificeren verschillende biologische parameters, zodatde resultaten van verschillende laboratoria kan worden cross-geïnterpreteerd. Voor een robuuste en reproduceerbare middelen voor kwantitatieve analyses op zaden, hebben we in-lab kernel testen en de daarop volgende methoden om schimmelgroei, biomassa en verontreiniging met mycotoxinen te kwantificeren. Vier gesteriliseerd maïskorrels worden geïnoculeerd in glazen flacons met een schimmel suspensie (10 6) en gedurende een vooraf bepaalde periode. Monsterflesjes worden vervolgens geselecteerd voor de telling van conidia van hemocytometer, ergosterol biomassa op analyse van hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC), aflatoxine kwantificering met een AflaTest fluorometer methode en fumonisine kwantificering van HPLC.
Protocol
1. Maïs Kernel Bioassay
- Twee weken vóór, kweken de schimmels op Potato Dextrose Agar (PDA) bij 28 ° C.
- Selecteer kernels met een vergelijkbare grootte en vorm, bij voorkeur plat leggen zodat ze gelijk met de onderkant van bioassay flacons, en plaats in 50 ml Falcon buizen. Geselecteerd Kernels moet tegelijkertijd zijn geproduceerd in dezelfde omgeving vergelijkbare zaad leeftijd en metaboliet samenstelling te verzekeren.
- Oppervlakte sterilisatie korrels door schudden buizen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met 70% ethanol, 1 minuut met steriel water en 10 minuten met 6% natriumhypochloriet. Spoel, drie keer, gedurende 5 minuten ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven methoden zijn uitvoerig getest en bewezen robuust te zijn bij het genereren van meetbare resultaten voor schimmelkolonisatie, sporogenesis, en de productie van mycotoxinen. Bovendien moeten deze technieken voor zaden van andere planten die gevoelig zijn voor besmetting met schimmels mycotoxigenic (bijvoorbeeld pinda's, tarwe, katoen, pistachenoten, enz.). Voor de bevoegde plant-pathogeen interactie analyses, is het noodzakelijk dat de zaden worden in leven gehouden. Een kleine wond op het embry.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Ik heb niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen graag Brandon Hassett en Carlos Ortiz bedanken voor hun technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de NSF subsidies IOB-0544428, IOS-0951272, en IOS-0925561 Dr Michael Kolomiets, en door de USDA Nationaal Instituut voor Voedsel-en Landbouworganisatie (NIFA), AFRI Plantenveredeling en onderwijs Grant # 2010 tot 85.117 -20.539 naar Drs. Seth Murray, Thomas Isakeit, en Michael Kolomiets.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalog # | |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientifc | S71659A | |
| Tween-20 | Fisher Scientifc | BP337-100 | |
| Plastic incubatie container | Sterilite | 1713LAB06 | |
| Blender | Vicam | 20200 | |
| 24 cm vouwfilter Papers | Vicam | 31240 | |
| 1,5 urn glas microvezel | Vicam | 31955 | |
| Afla testzuil | Vicam | G1024 | |
| Afrla Test Ontwikkelaar | Vicam | 32010 | |
| Methanol | Vicam | 35016 | |
| Acetonitril | Fisher Scientifc | AC14952-0025 | |
| Ethanol | Fisher Wetenschappentifc | AC39769-0025 | |
| C-18 vaste fase extractie kolom (Prep september SPE C18 kolom) | Fisher Scientifc | 60108-304 | |
| O-ftalaldehyde (OPA) | Sigma Chemical Co | 79760-5g | |
| Boorzuur | Fisher Scientifc | BP168-500 | |
| Natriumboraat | Fisher Scientifc | RDCS0330500 | |
| Mercaptoethanol | Fisher Scientifc | 45-000-231 | |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (pomp) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc | LC-20AT | |
| Zorbax ODS kolom (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 | |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescentiedetector | Shimadzu Scientific Instruments, Inc | RF-10AXL | |
| Natriumfosfaat | Fisher Scientifc | AC38987-0010 | |
| FB1 normen | Sigma Chemical Co | F1147-1 mg | |
| Chloroform | VWR | MK444410 | |
| 13 mm spuitfilter met 0,45 um nylon membraan (HPLC) | Pall Life Science | 4426 | |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F | |
| Scintillatieflesjes | VWR | 66021-602 | |
| Natriumchloride | Vicam | G1124 |
Referenties
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
