La dévastation des cultures céréalières par moisissures infectant les semences a incité de nombreux efforts de recherche afin de mieux comprendre les interactions plante-pathogène. Pour étudier les semences fongiques interactions dans un environnement de laboratoire, nous avons développé une méthode robuste pour la quantification de la reproduction des champignons, la biomasse et contamination par les mycotoxines en utilisant des essais biologiques du noyau.
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Article de méthode
Quantification de la colonisation fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines utilisant Bioassays noyau
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le pourrissement des grains par moisissures infectant les semences constitue l'un des plus grands défis économiques dans le monde entier à la production de céréales, sans parler des risques graves pour la santé humaine et animale. Parmi la production céréalière, le maïs est sans doute la culture la plus touchée, en raison de pertes dues à des agents pathogènes dans l'intégrité du grain et de la contamination des semences par les mycotoxines. Les deux mycotoxines les plus répandues et problématiques pour les producteurs de maïs et de la nourriture et les transformateurs d'alimentation sont les aflatoxines et les fumonisines, produite par Aspergillus flavus et Fusarium verticillioides, respectivement.
Des études récentes dans moléculaires des interactions plante-pathogène ont montré prometteur dans la compréhension des mécanismes spécifiques associés à des réponses de plantes à l'infection fongique et 1,2,3,4,5,6 contamination par les mycotoxines. Parce que de nombreux laboratoires sont en utilisant des tests du noyau pour étudier les interactions plante-pathogène, il existe un besoin pour une méthode normalisée pour quantifier différents paramètres biologiques, de sorterésultats des différents laboratoires peuvent être contre-interprété. Pour un moyen fiable et reproductible pour des analyses quantitatives sur les semences, nous avons développé des essais du noyau en laboratoire et des méthodes suivantes pour quantifier la croissance fongique, la biomasse, et la contamination par les mycotoxines. Quatre grains de maïs stérilisés sont inoculés dans des flacons en verre avec une suspension fongique (10 6) et incubé pendant une période prédéterminée. Flacons à échantillon sont ensuite sélectionnés pour le dénombrement des conidies par l'analyse de la biomasse hémocytomètre, basée sur l'ergostérol par chromatographie liquide haute performance (HPLC), la quantification aflatoxine en utilisant une méthode AflaTest fluorimètre, et la quantification des fumonisines par HPLC.
Protocole
1. Essais biologiques grain de maïs
- Deux semaines avant, la culture des champignons pathogènes sur Potato Dextrose Agar (PDA) à 28 ° C.
- Sélectionnez les noyaux avec la taille et de forme semblables, de préférence aplatie afin qu'ils jeter au niveau du fond des flacons de dosage biologique, et les placer dans des tubes de 50 ml de faucon. Noyaux sélectionnés doivent avoir été produites simultanément dans un même environnement pour assurer l'âge de semences ou de composition analogue métabolite.
- Surface stériliser les noyaux en secouant tubes à température ambiante pendant 5 minutes avec de l'éthanol 70%, 1 minute à l'eau ....
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Discussion
Les méthodes décrites ici ont été largement testées et éprouvées pour être robuste dans la génération des résultats quantifiables pour la colonisation fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines. En outre, ces méthodes devraient être applicables aux semences des espèces végétales autres qui sont sensibles à la contamination par des champignons (par exemple les arachides mycotoxigéniques, blé, coton, pistaches, etc.) Pour compétentes analyses d'interaction plante-pathogène, il est impératif que les grai.......
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Déclarations de divulgation
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Remerciements
Nous tenons à remercier Brandon Hassett et Carlos Ortiz pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par la NSF subventions IOB-0544428, 0951272-IOS, IOS et-0925561 au Dr Michael Kolomiets, et par l'Institut national de l'USDA pour l'alimentation et l'agriculture (NIFA), l'amélioration des plantes et de l'éducation AFRI Grant # 2010-85117 -20539 à MM. Seth Murray, Thomas Isakeit, et Kolomiets Michael.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Catalogue # | |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientifique | S71659A | |
| Tween-20 | Fisher Scientifique | BP337-100 | |
| Récipient d 'incubation en plastique | Sterilite | 1713LAB06 | |
| Mixer | Vicam | 20200 | |
| 24 cm Filtres plissés | Vicam | 31240 | |
| 1,5 microfibres de verre pm | Vicam | 31955 | |
| Colonne de test afla | Vicam | G1024 | |
| Afrla test pour un développeur | Vicam | 32010 | |
| Le méthanol | Vicam | 35016 | |
| Acétonitrile | Fisher Scientifique | AC14952-0025 | |
| L'éthanol | Fisher Scientifc | AC39769-0025 | |
| Colonne C-18 extraction en phase solide (SPE Prep septembre colonne C18) | Fisher Scientifique | 60108-304 | |
| O-phtalaldéhyde (OPA) | Sigma Chemical Co | 79760-5g | |
| L'acide borique | Fisher Scientifique | BP168-500 | |
| Le borate de sodium | Fisher Scientifique | RDCS0330500 | |
| Mercaptoéthanol | Fisher Scientifique | 45-000-231 | |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (pompe) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc | CL-20AT | |
| Zorbax ODS colonne (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 | |
| Shimatzu RF-10Axl détecteur de fluorescence | Shimadzu Scientific Instruments, Inc | RF-10AXL | |
| Phosphate de sodium | Fisher Scientifique | AC38987-0010 | |
| FB1 normes | Sigma Chemical Co. | F1147-1mg | |
| Chloroforme | VWR | MK444410 | |
| Filtre 13 mm seringue à 0,45 um membrane de nylon (HPLC) | Pall Life Science | 4426 | |
| L'ergostérol | Sigma-Aldrich | 45 480-50G-F | |
| Flacons à scintillation | VWR | 66021-602 | |
| Chlorure de sodium | Vicam | G1124 |
Références
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M.
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Réimpressions et autorisations
