Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.
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Methodenartikel
Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Knochenmark ist der wichtigste Ort, wo HSCs und reifer Blutzellen Abstammung Vorfahren wohnen und differenzieren in einem erwachsenen Organismus. Blutstammzellen bilden eine Minute Zellpopulation von pluripotenten Zellen zu erzeugen vermag alle Blutzelllinien für ein Leben-Zeit ein. Die molekulare Aufklärung von HSK-Homöostase im Knochenmark hat wichtige Auswirkungen in der Hämatopoese, der Onkologie und der regenerativen Medizin. Wir beschreiben die Kennzeichnung Protokoll mit fluoreszierenden Antikörpern und dem elektronischen Gating Verfahren in der Durchflusszytometrie auf hämatopoetischen Vorläuferzellen Teilmengen und HSCs Verteilung in einzelnen Mäusen (Abb. 1) punkten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, um ausgiebig zu bereichern hämatopoetischen Vorläuferzellen als auch langfristige (LT) und kurzfristige (ST) Rekonstituieren Blutstammzellen aus dem Knochenmark gepoolten Zellsuspensionen von magnetischen Anreicherung von Zellen, die c-Kit. Die resultierende Zelle Herstellung verwendet werden, um ausgewählte Teilmengen für die in vitro zu sortieren undIn-vivo-funktionelle Untersuchungen (Abb. 2).
Beide trabekulären Osteoblasten 2,3 und sinusförmige Endothel 4 bilden funktionale Nischen Unterstützung von Blutstammzellen im Knochenmark. Mehrere Mechanismen in der osteoblastischen Nische, einschließlich einer Teilmenge von N-Cadherin + Osteoblasten 3 und Wechselwirkung des Tie2-Rezeptor-Tyrosinkinase im HSK mit seinem Liganden Angiopoietin-1 5, ausgedrückt stimmen bei der Bestimmung HSK Ruhe. "Ruhezustand" im Knochenmark ist entscheidend für die HSK von der Replikation und eventuelle Erschöpfung bei übermäßiger Aktivität Radfahren 6 zu schützen. Exogene Stimuli, die auf Zellen des angeborenen Immunsystems, wie Toll-like-Rezeptor-Liganden 7 und Interferon-α 6 kann auch induzieren Proliferation und Differenzierung von Blutstammzellen in Linie festgelegte Vorläuferzellen. Kürzlich wurde eine Population von schlafenden Blutstammzellen in der Maus lin - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - Population wurde bisher 8 beschrieben. Sortieren von Zellen auf CD34-Expression aus der hämatopoetischen Vorläuferzellen angereicherten Zellsuspension, wie hier beschrieben Basis ermöglicht die Isolierung von sowohl ruhende selbst erneuernden LT-HSK und ST-HSK 9. Ein ähnliches Verfahren auf Erschöpfung der Linie positive Zellen und Sortierung von LT-HSC mit CD48-Antikörpern und flk2 Basis wurde bereits 10 beschrieben. Im vorliegenden Bericht stellen wir ein Protokoll für die phänotypische Charakterisierung und Ex-vivo-Zellzyklus-Analyse von hämatopoetischen Vorläuferzellen, die nützlich für die Überwachung der Hämatopoese in verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen kann. Darüber hinaus beschreiben wir ein Verfahren FACS-Sortierung für HSK, die verwendet werden, um Faktoren und Mechanismen, die ihre Selbst-Erneuerung, Erweiterung und Differenzierung in der Zellbiologie und Signaltransduktion Assays sowie für die Transplantation definiert werden können.
Protokoll
1. Vorbereitung der Zellsuspension aus dem Knochenmark
- Euthanize die Maus und platzieren Sie das Tier in einer Pfanne Edelstahl und Spray 70% Ethanol auf seinen Bauch und Rücken. Sammeln Sie Oberschenkel und Schienbein von Hinterbeinen und Wirbelsäule.
- Exakt entfernen Sie alle Rückstände aus der Weichteile der Wirbelsäule mit einer scharfen Spitze Schere und Beine aus Knochen mit einer Gaze. Shop Knochen in einem 50-ml-Falcon-Röhrchen mit 30 ml RPMI-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), mit 50 uM β-Mercaptoethanol, 100 pM MEM nicht-essentielle Aminosäuren ergänzt, 1 mM MEM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml Strept....
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Diskussion
Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine schnelle und genaue Analyse der Hämatopoese in einzelnen Mäusen (Abbildung 1). Diese Analyse in verschiedenen experimentellen Einstellungen, einschließlich Mausmodell von Entzündungen, Autoimmunerkrankungen, Immundefizienz, degenerative Erkrankungen, Stoffwechselstörungen und Krebs, ermöglicht der Bewältigung der Folgen von pathologischen Zuständen, auf die Hämatopoese. Abbildung 3 zeigt die Analyse der Zellzyklus-Aktivität auf elektronisch .......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa und Markus Manz für wertvolle Ratschläge. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds, Krebsliga Schweiz und Tessiner Fondazione per la ricerca sul Cancro finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 | |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 | |
| Natriumpyruvat | Gibco | 11360 | |
| PenStrep | Gibco | 15070 | |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Zellsieb 40 um | BD Falcon | 352340 | |
| 7-AAD Färbelösung | BD Pharmingen | 559925 | |
| Lyse / Fix-Puffer | BD Pharmingen | 558049 | |
| Perm Puffer III | BD Pharmingen | 558050 | |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 | |
| CD8 (53-6,7) | eBioscience | 150081 | |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 | |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 | |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 | |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 | |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 | |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 | |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 | |
| Sca-1 (D7) | eBiosciENCE | 135981 | |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 | |
| FcyR (2.4G2) | eBioscience | 553145 | |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
Referenzen
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
