Summary
这份报告介绍了利用活细胞成像和光漂白技术，以确定表面的表达，运输途径和贩运外生表示，pH敏感的绿色荧光蛋白标记的蛋白质在神经元细胞膜动力学。
Abstract
Protocol
1。细胞培养，病毒转导，蛋白表达
- 文化高密度聚-L-赖氨酸涂层玻片为14-25天（DIV）， 在体外胚胎18天（E18）幼鼠海马神经元。
- 6 - 24小时前的现场实验，减毒辛德毕斯病毒的转导细胞中含有利益的膜蛋白，与黄道超pHluorin（SEP）的标签。
- 直接添加pseudovirion含中等盖玻片含1毫升的空调媒体和文化的孵化器。滴度和病毒转导蛋白表达的时间将取决于病毒批次而有所不同，并应为每个活细胞实验开始前，一批确定。
2。 FRAP还原-FLIP的活细胞成像
- 设备设置
- 蔡司Axiovert LSM的510的META共聚焦显微镜成像室的盖玻片转移。成像，以尽量减少在电源波动，确保显微镜已接通，至少有20分钟与100％的激光输出，前成像。
- 立即更换培养基预温（37°）外的录音解决方案，其中包含140 mM氯化钠，氯化钾5毫米，1.5毫米氯化镁 ， 氯化钙 1.5毫米，15毫米葡萄糖，20-25毫米肝素钠（调pH至7.4用NaOH）和蔡司Axiovert预热阶段（37℃）放置室。
确保外的录音解决方案渗透压调整10培养基mOsM内到。提供无显着性的蒸发在实验timecourse发生，这种合作的2个独立的解决方案是适合短期实验（<10小时）。 1-2毫米碳酸氢钠补充建议。
- 定义成像捕获参数
- 首先，确定一个神经细胞表达的重组亲蛋白的利益，并使其成为焦点。
- 随着63X石油反对，获得整个细胞，使用488nm激光激发激光功率低的形象。为了尽量减少漂白，使用快速的额定转速（7-9）和低像素的分辨率（512-512），保持总的扫描速度<1秒。
- 选择部分图像和缩放的枝蔓捕获一帧包含的投资回报率（〜1.5-2.5倍的光学变焦）。在可能的情况下，确保视野包含多个进程，这样可以得到参考树突测量，以确定如果非特定的漂白，由于收购发生。
- 调整过滤器，针孔，扫描速度和检测器从最小的激光激发，但有限的饱和增益使最大荧光。一个大型的针孔直径的建议，以最大限度地提高光子收集（2μm的是适合刺和三元树突）。探测器的增益应该强大到足以检测小的荧光增量，例如，第一图像之前，漂白，不克服饱和像素的10％。
- 保存前/后漂白剂和复苏阶段的实验中使用的配置。
- 接下来定义的光漂白地区;选择一个初始光漂白和随后的重复漂白阶段的侧翼地区的投资回报率。确保足够宽，以防止扩散扫描（一般为5微米，见图2）之间恢复侧翼地区。
- 调整漂白光漂白的投资回报为参数。初始光漂白应该迅速（0.1-0.5秒）需要1-5迭代之间，视光学变焦和投资回报率的体积。激光激发的侧翼地区，应进行调整，以确保侧翼地区连续漂白，但没有光毒性损害。
- 作为一个准则，我们使用100％的初始光漂白激光激发，10％的重复漂白pH值ASE。
- 图像采集
- 一旦所有参数已经确定，执行作为一个变量的时间推移图像序列FRAP还原翻转实验，在下面4块概述：
1座3-10预漂白基线图像，在激光功率低，没有时间延迟
2座：光漂白完整的激光功率的中央投资回报率在1-5迭代
3座3-10漂白后恢复映像
4座：激光功率中等的地区，典型的时间间隔为1侧翼图像采集重复的光漂白 - 5秒取决于正在调查中的蛋白质的回收率。 - 最后，更换与PH6含有140 mM氯化钠，氯化钾5毫米，15mm的葡萄糖， 氯化钙 1.5毫米，1.5毫米氯化镁 ，MES（解渴荧光）20-25毫米或50毫米补充缓冲的录音解决方案外的录音解决方案氯化铵含有90 mM氯化钠，氯化钾5毫米，15毫米葡萄糖， 氯化钙 1.8毫米，0.8毫米MgCl 2的 20-25毫米肝素钠，PH7.4（揭示在低pH值的细胞内储存的蛋白质），（见图2）。
- 至少有10至20个数据集，收集各重组蛋白，使统计分析。为了避免偏见的结果，确保成像条件保持一致跨越复制。丢弃任何数据集，其中不完全漂白，显着焦平面漂移或光毒性细胞损伤观察。
- 一旦所有参数已经确定，执行作为一个变量的时间推移图像序列FRAP还原翻转实验，在下面4块概述：
3。数据分析
- ImageJ的软件打开图像。
- 对齐栈：刚体在xy平面上的小波动可能发生的整个时间系列使用Stackreg插件（插件→stackreg→改造→
）。 - 对于蔡司聚焦拍摄的图像，使用LSM的工具箱插件，报告为一个文本文件的时间值（插件→LSM的工具箱→显示LSM的工具箱→
→ ）分析电子表格导入这些值。 - 来衡量FRAP还原倒装实验过程中的荧光波动，划分成单个像素区域（20pixels）photobleached段，并在每个时间点（F）的衡量这些投资回报的平均荧光。快速获取这些值，选择多个投资回报使用ImageJ的“投资回报率管理的分析工具（分析→工具→投资回报率经理）和报告使用的阴谋Z轴配置文件”命令（每个像素的平均荧光图像→堆叠→图Z轴轮廓）。
- 重复此步骤来衡量的背景下，非荧光区的荧光强度。
- 在每个时间点的荧光强度，减去背景值，以消除实验噪音，所有的值除以平均预漂白基线措施正常化。
- 测量相邻的非photobleached树突荧光的强度，以评估非特异性水平漂白过程中采集。非特异性漂白修正气馁FRAP还原-FLIP的数据的解释，并应尽可能避免。
- 来计算，如果已明显复苏中的投资回报率的地方，从第一（ΔF）5-10措施的平均值减去平均序列的最后5-10措施，并确定统计意义。分类的恢复和非恢复的投资回报来评估胞吐模式（即胞吐热点或脊椎与轴恢复）。
4。代表结果
FRAP还原典型的倒装实验的结果显示图。 2。在这里，一个神经元表达GluA2亚基的AMPA型谷氨酸受体与SEP标签，已选择性photobleached沿枝的地区。图2.A说明的的枝蔓地区已成像，并表示已漂白（白框区域）选择的投资回报。日é白色大盒装面积漂白一次，其次是重复的侧翼盒装双头蓝色箭头突出的地区，漂白。红色箭头表示测得的投资回报率，高倍率在较低的面板中显示。
2.B图，显示在实验过程中测量投资回报率的荧光强度。在这个例子中，一分钟恢复期内录得的初始光漂白后允许棉纱受体进入横向扩散的投资回报率。当photobleached侧翼地区，从这个高度能动的分数受体荧光信号被遮挡从中部地区，这些区域内的稀释。因此，可以在观察荧光（ΔF）增加了“翻转”序列插入的SEP GluA2的树突状轴。低pH清洗和pH值7.4 +氯化铵除了分别确认，测量的荧光从表面派生蛋白质和揭示内，幽静的蛋白质的比例，在衡量投资回报率。
在FRAP还原力的对比，这种方法隔离恢复由于胞吐，大大降低了在一个荧光恢复在photobleached地区的水平。迄今为止还没有任何可靠的数学模型已经开发，以适应和分析恢复跟踪记录使用这种选择性漂白技术。然而，这是可能的，以适应与一个单一指数复苏复苏跟踪：
F（T）= S - 0 E（-T /τ）
其中F（t）是在时间t的荧光， 一个 S是稳态值，0是在时间0的偏移量，τ是时间常数。恢复性增长是固定的一个给定的汇率达到平衡，相应的稳定状态之间的插入和扩散。重要的是，这是一个时间常数提取nalysis并不反映的胞吐的时间常数，并且只能用于个别蛋白的比较治疗。
此外，荧光恢复的预期模式很可能将在子域观察沿photobleached地区。小内photobleached段的投资回报率分析可能是必要的揭示胞吐的“热点”和分析可比长度之间的枝蔓这些斑点的密度变异的地区，将影响计算速度，这是明智的。
图3显示了此协议的扩展，应用光漂白视野中的多个树突大断面的投资回报率，其次是选择性重复只有一个枝漂白。这种方法使传统的“FRAP还原”和“FRAP还原翻转”并行采集的数据。海马神经元在这个例子中，已感染的红藻氨酸类的谷氨酸受体亚基独立日标签GluK2。 PRIOr来成像，这些神经元的治疗cylcohexamide（在200μg/ml2小时），阻止蛋白质的合成。正因为如此，在各自的衡量投资回报（图3.B）的荧光恢复显示恢复的比例，由于横向扩散和FRAP还原枝的标准与回收FRAP还原，翻转“协议的枝蔓单独回收。 FRAP还原与FRAP还原-FLIP的“恢复曲线，回收的相对贡献（ΔFREC = 11.05％）与横向扩散（ΔF 差异 = 9.35％）比较ΔF值可以推断。与图2不同的是，经济复苏不保持一个稳定的状态，而是由于抑制蛋白质的合成，显示了一个短暂的增加和随后的信号，相应的落客耗尽可用的受体池（约20％的跌幅观察在录音期间）。
图1。FRAP还原与FRAP还原-FLIP的协议，这个原理说明了一个与“FRAP还原翻转”协议定期FRAP还原力的结果，使用sep标签受体校长的示意图。荧光恢复传统FRAP还原显示在左侧。在中央投资回报率的测量荧光恢复归因于横向扩散F非photobleached SEP-标签通过回收和/或从头到树突状轴的胞吐以外的photobleached的ROI和插入受体的受体结合。相比之下，在右侧所示的侧翼的ROI重复photobleached，显示FRAP还原翻转“协议修改后的”沉默的复苏，由于横向扩散。因此，任何测得的荧光恢复，可以归因于在投资回报率的直接插入。
图2。插入到细胞膜上的树突状轴SEP-GluA2
A）海马神经元表达SEP-GluA2，选择性地photobleached沿着枝蔓地区。原理说明枝地区已成像，而左上角的手面板突出已选定为漂白的投资回报。白色大盒装面积漂白一次，其次是重复的侧翼盒装双头蓝色箭头突出的地区，漂白。此面板显示的枝蔓前漂白。红色箭头表示测得的投资回报率，高倍率在较低的面板中显示。 B）显示的时间在实验过程中测得的投资回报率在荧光强度，绘制灰度等级在投资回报率（不归）。黑色箭头突出的时间点的初始光漂白和绿色箭头表示开始重复漂白。 ΔF表示日ê增加在恢复期内观察荧光，由于的SEP GluA2的树突状轴插入。随后的低pH值和pH值7.4 +，NH 4氯洗确认，恢复荧光涉及到表面表达的受体。
图3对树突状轴cyclohexamide治疗后的回收和横向扩散的SEP-GluK2 VS回收。
A）海马神经元表达SEP-GluK2，选择性photobleached平行FRAP还原力和FRAP还原翻转“恢复执行协议沿着单独的树突状的ROI。这个神经元是受预处理，与cyclohexamide，阻止蛋白质的合成，在200微克/毫升（2小时）。原理说明的的枝蔓地区已成像，而左手面板突出的漂白已选定的ROI。日é白色大盒装面积漂白一次，重复的侧翼盒装地区的低枝双头蓝色箭头强调，漂白。此面板显示前漂白树突。红色箭头突出高倍率在 B所示的投资回报）说明FRAP还原传统的荧光恢复与“FRAP还原翻转”协议。在复苏后期（第三小组）的荧光强度水平的比较结果显示，独自与回收的横向扩散和回收的贡献。）显示荧光强度，在实验过程中测量的ROI在作为归强度绘制值。黑色箭头突出的时间点的初始光漂白和绿色箭头表示开始重复漂白。 ΔF 建议表示FRAP还原/翻盖枝确定由于受体再造，瞬态恢复，而ΔF差异措施纳入树突轴“FRAP还原唯一的投资回报率横向扩散的SEP GluK2的贡献。瞬时增加，其次是逐步下降的信号，相应的可用受体运行cyclohexamide治疗。随后的低pH值和pH值7.4 +，NH 4氯洗确认，恢复荧光涉及到表面表达的受体。
Discussion
我们描述了一个创新的战略，可视化组件的质膜蛋白质贩运。选择性漂白技术与SEP-标记蛋白相结合的方法，使细胞膜插入事件进行评估。通过不断漂白侧翼地区在恢复过程中的膜蛋白，FRAP还原，倒装的方法评估荧光恢复水泡贩运的贡献。这种新方法可直接录制蛋白膜插入，使副舱室的数量都在恢复观察，在稳定状态恢复的幅度（ΔF）待定。此外，FRAP还原力比较与不倒装允许恢复的比例应占计算的横向扩散。
此外，在相同的实验，相邻侧翼photobleached地区的的非photobleached枝的地区可定性评估在恢复过程中，在这些地区观察到的荧光损失是由于横向扩散photobleached受体对树突这些非photobleached的分部。
这种选择性漂白协议可以用来探讨各种excocytosis在质膜中定义的子区域特征（例如，刺或树突）或评估的横向扩散与插入进行并行FRAP还原的贡献和FRAP还原如蜂窝贩运过程沿相邻的树突-FLIP的“协议（图3）。
显然，已提出具体的指导方针，同时，每个实验室将需要根据特定的标本和设备的成像参数优化。重要的是，在所有的投资回报率表面受体需要photobleached，Z轴焦平面独立，但没有显着的光毒性损伤或非特异性漂白。我们ERS时，应谨慎试图在胞体这个协议，因为高比例的内舱相对较低的pH值通常是在这些地区的高背景荧光的结果。此外，虽然我们已经证明如何这项技术可以应用在不同的方式选择性漂白实验开始前，一个新的SEP-标签的构造，我们建议首先进行标签受体的初步鉴定，Ashby等2。
总的来说，这个方法是一个标准的FRAP还原协议的强大和灵活的适应，能够插入细胞膜近实时评估的事件。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
威康信托基金和财政支持的ERC，我们非常感谢。 IMGG是欧洲分子生物学研究员。 KLH的是BBSRC的资助博士生。我们感谢菲利普·鲁宾和帕特里克蒂德博尔的技术和细胞培养的支持和安德鲁·多尔蒂博士与显微镜的维护和协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24mm glass coverslips | VWR international | 631-0161 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | 1mg/ml in borate buffer to coat coverslips |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 2% in neuronal plating and feeding medium |
| Penicillin Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 1% in neuronal plating and feeding medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 2mM / 0.8mM in plating/feeding medium |
| Horse Serum | Biosera | DH-291H | 10% in neuronal plating media only |
| pSIN ReP5 cloning vector | Invitrogen | K75001 | For Sindbis virus production |
| LSM510 META confocal system | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Image J Software | National Institutes of Health | open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/ |
References
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