Summary
Denna rapport beskriver användningen av levande cell imaging och tekniker photobleach att bestämma ytan uttrycket vägar transport-och kinetik handel med exogent uttryckt, pH-känslig GFP-märkta proteiner vid plasmamembranet av nervceller.
Abstract
Protocol
1. Cellodling, viral transduktion, och Protein Expression
- Kultur med hög densitet hippocampala neuroner från embryodag 18 (E18) råttungar på poly-L-lysin-belagda täckglas för 14-25 dagar in vitro (DIV).
- 6-24 timmar före levande experiment, transducera celler med försvagat sindbisvirus innehåller membranprotein av intresse, märkt med super-ekliptikan pHluorin (SEP).
- Tillsätt pseudovirion-innehållande mediet direkt på täckglaset innehållande 1 ml av konditionerat medium och återfördes till inkubatorn kulturen. Titern och tid för proteinexpression efter viral transduktion kommer att variera beroende på det virus parti och bör bestämmas för varje sats före påbörjandet levande cell experiment.
2. FRAP-FLIP levande cell imaging
- Utrustning set-up
- Överför täckglaset till avbildning kammare i ett Zeiss Axiovert LSM 510 META konfokalmikroskop.För att minimera spänningsvariationer under avbildning, se i mikroskop har slagits på, med 100% laserutskrifter under minst 20 minuter före avbildning.
- Omedelbart, ersätta odlingsmediet med förvärmd (37 ° C) extracellulär registrering lösning innehållande 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glukos, 1,5 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM HEPES (pH justerat till 7,4 med NaOH) och placera kammaren på förvärmda steg (37 ° C) för Zeiss Axiovert.
Säkerställa osmolaritet av den extracellulära inspelning lösningen justeras till inom 10 mOsM din odlingsmedium. Förutsatt att inga betydande avdunstning uppstår under tidsförloppet av experimentet, detta är CO 2 oberoende lösning som är lämplig för korta experiment (<10 timmar). Komplettering med 1-2 mM natriumbikarbonat rekommenderas.
- Definiera parametrarna bildbehandling
- Först identifiera en neuron som uttrycker den rekombinanta proTEIN av intresse och få det att fokus.
- Med en 63X olja invände, skaffa sig en bild av hela cellen med 488 nm excitation laserljus med låg lasereffekt. För att minimera fotoblekning, använd en snabb nominellt varvtal (7-9) och låg upplösning (512-512) att hålla den totala skanningshastighet <1 sekund.
- Välj en del av Dendrite till bilden och zooma för att fånga en ram som innehåller ROI (~ 1,5-2,5 x optisk zoom). Om möjligt, se till att synfältet innehåller flera processer så att mätningar från referens dendriter kan erhållas för att avgöra om icke-specifik fotoblekning på grund av förvärvet sker.
- Justera filter, hål, skanningshastighet och detektor vinst att maximal fluorescens från minimal laserexcitation men med begränsad mättnad. En stor hål diameter rekommenderas för att maximera foton samlingen (2 pm är lämplig för ryggar och dendriter ternära). Detektorn vinsten skall vara stark nog för att upptäcka små fluorescens steg,så att de allra första bilderna, före fotoblekning inte komma 10% av mättade pixlar.
- Spara denna konfiguration som ska användas för före / efter-blekmedel och återställande av försöket.
- Nästa definiera photobleach regionerna, välja en ROI för den första photobleach och flankerande regioner för den efterföljande repetitiva fotoblekning fas. Se de flankerande regionerna är tillräckligt brett för att förhindra återvinning av diffusion mellan avsökningar (typiskt 5 | im, se fig. 2).
- Justera blekmedel parametrar för både photobleach ROI. Den ursprungliga photobleach bör vara snabb (0,1-0,5 sek) kräver mellan 1-5 iterationer, beroende på den optiska zoom och volym ROI. För de flankerande regionerna bör laserexcitation justeras för att säkerställa kontinuerlig fotoblekning av de flankerande regionerna, men utan fototoxisk skada.
- Som en riktlinje, använder vi 100% laserexcitation för den första photobleach och 10% för repetitiva fotoblekning phase.
- Bildinsamlande
- När alla parametrar har ställts in, utföra FRAP-FLIP experiment som en variabel time-lapse bildsekvens, som beskrivs i de 4 blocken nedan:
Block 1: 3-10 pre-bleka baseline bilder vid låg lasereffekt, ingen tidsfördröjning
Block 2: Photobleach centrala ROI vid full laser effekt, 1-5 iterationer
Block 3: 3-10 efter bleka återhämtning bilder
Block 4: Upprepad photobleach av kompletterande regioner på medellång lasereffekt med bild fånga vid en typisk tid av 1 - 5 sekunder, beroende på återvinningsgraden av proteinet under utredning. - Slutligen ersätter den extracellulära registreringslösning med inspelning lösning buffrad vid pH 6 innehållande 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glukos, 1,5 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM MES (för att släcka fluorescens) eller kompletterat med 50 mM NH4CI innehållande 90 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glukos, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mMMgCl2, 20-25 mM HEPES, pH 7,4 (för att avslöja de proteiner i låga pH intracellulära förråd), (se Fig. 2).
- Samla minst 10 till 20 datauppsättningar för varje rekombinant protein, för att möjliggöra statistisk analys. För att undvika bias resultat, se avbildning förhållandena bibehålls konsekvent över replikat. Kassera datauppsättningar där ofullständig blekning, betydande fokalplanet drift eller fototoxisk cellskador observeras.
- När alla parametrar har ställts in, utföra FRAP-FLIP experiment som en variabel time-lapse bildsekvens, som beskrivs i de 4 blocken nedan:
3. Dataanalys
- Öppna bilder med ImageJ mjukvara.
- Anpassa de staplar som svarar för små fluktuationer i xy-planet som kan ha inträffat under tidsserie med Stackreg insticksprogram (instick → stackreg → omvandling: stel kropp →
). - För bilder som tagits på Zeiss konfokal använder plugin LSM Toolbox att rapportera tidsvärdena som en textfil (plugins → LSM Toolbox → Visa LSM Toolbox →
→ ),och importera dessa värden till en analys av kalkylblad. - Att mäta fluorescens fluktuationer vid FRAP-FLIP experiment dela photobleached segmentet i individuella pixel regioner (cirka 20pixels) och mäta den genomsnittliga fluorescensen av dessa ROI vid varje tidpunkt (F). Att snabbt få dessa värden, välja flera ROI med ImageJ "ROI Manager" analysverktyg (Analysera → Verktyg → ROI Manager) och rapportera medelfluorescensen per pixel med 'Plot Z-axeln profil "kommandot (Bild → Stacks → Plot Z -axeln profil).
- Upprepa detta steg för att mäta fluorescensintensiteten för en bakgrund, icke fluorescerande regionen.
- Normalisera fluorescensintensiteten vid varje tidpunkt genom att subtrahera bakgrundsvärdena för att ta bort experimentell buller, och dividera alla värden med medelvärdet före blekt baslinjen åtgärd.
- Mät fluorescensintensiteten av närliggande icke photobleached dendriter för att bedöma nivån av icke-specifikfotoblekning under förvärvet. Korrigering för icke-specifik fotoblekning motverkas för tolkning av "FRAP-flip" Data och bör undvikas om möjligt.
- För att beräkna om betydande återhämtning har skett i en ROI, subtrahera medelvärdet av sista 5-10 åtgärder sekvensen från medelvärdet av de första 5-10 åtgärder (Af) och bestämma statistisk signifikans. Kategorisera återvinna och icke-återhämtar ROI för att bedöma mönstret för exocytos (dvs. exocytos hotspots eller ryggrad vs axel återvinning).
4. Representativa resultat
Resultatet av typiska FRAP-FLIP experiment visas i figur. 2. Här har en neuron som uttrycker GluA2 subenheten av AMPA-typ glutamatreceptorer, märkt med september har selektivt photobleached längs en region av dendrit. Fig 2.A illustrates the region of dendrite which has been imaged and indicates the ROIs that have been selected for photobleaching (white box regions). The stora vita inramade området var blekt en gång, följt av upprepad blekning av de flankerande inramade regionerna markerade med dubbla leds blå pilar. Den röda pilen visar den uppmätta ROI, som visas i hög förstoring i de lägre panelerna.
Fig. 2.B visar fluorescensintensiteten i den uppmätta ROI över tidsförloppet för experimentet. I detta exempel framställdes en minut återhämtningsperiod registrerades efter den initiala photobleach att tillåta oblekta receptorer för att komma in i ROI genom diffusion i sidled. När de flankerande regionerna photobleached är fluorescenssignalen från denna mycket motila fraktion av receptorer blockeras från det centrala området, och de inom området späds ut. Ökningen i fluorescens (AF) observerades över "FLIP" sekvensen kan därför tillskrivas insättning av SEP-GluA2 i det dendritiska skaft. Det låga pH tvätt och pH 7,4 + NH4Cl Dessutom bekräftar respektive att den uppmätta fluorescensen härrör från ytanproteiner och avslöjar hur stor andel av intracellulära och komplexbundna proteiner i den uppmätta ROI.
I motsats till FRAP, isolerar denna metod återhämtning på grund av exocytos, vilket resulterar i en kraftigt reducerad nivå av fluorescens återhämtning i photobleached regionen. Hittills inga tillförlitliga matematisk modell har utvecklats för att passa och analysera återhämtningen spårar in med denna selektiva blekning teknik. Det är emellertid möjligt att montera återhämtning spår med en mono exponentiell återhämtning:
F (t) = A ^ - A 0 e (-t / τ)
Där F (t) är fluorescens vid tiden t, är Ag fasta värdet, A 0 är förskjutna i tiden 0 är τ tidskonstanten. Återhämtningen tillväxt är fäst med en given hastighet för att nå en jämvikt, som svarar mot ett stationärt tillstånd mellan införande och diffusion. Viktigare, extraherades tidskonstanten från denna enANALYS återspeglar inte tidskonstanten för exocytos och kan endast användas för jämförande behandlingar för en individuell proteinet.
Dessutom är den förväntade mönstret av fluorescens troligt att återhämtningen skall iakttas vid sub-domäner längs photobleached regionen. Analysis of small ROI within a photobleached segment may be essential to reveal exocytosis "hotspots" and it is advisable to analyse regions of comparable lengths as the variability of density of these spots among the dendrite will affect the calculated rate.
Figur 3 visar en förlängning av detta protokoll, med tillämpning av photobleach till stora del ROI med flera dendriter i synfältet, följt av selektiv upprepad blekning av endast en dendrit. På så sätt kan traditionella "FRAP" och "FRAP-flip" data som skall förvärvas parallellt. I detta exempel har hippocampala neuroner har infekterats med en glutamatreceptor-subenheten av kainat klassen; SEP-märkt GluK2. Prior till avbildning, var nervceller-dessa behandlas med cylcohexamide (2 timmar vid 200μg/ml), för att blockera proteinsyntesen. Som sådan, fluorescens återhämtning i den uppmätta respektive ROI (Fig. 3 B) visar hur stor andel av återhämtningen på grund av lateral diffusion och återvinning i standarden FRAP dendritliknande jämfört återvinning ensam i dendritliknande utsätts för "FRAP-FLIP" protokollet. Jämföra Af värdena från FRAP kontra "FRAP-flip" återhämtning kurvor, de relativa bidragen från återvinningen (Af REC = 11,05%) jämfört med laterala diffusion (AF diff = 9,35%) kan härledas. Till skillnad från Figur 2, inte återhämtningen inte upprätthålla en steady state-nivån utan snarare på grund av hämning av proteinsyntesen, visar en övergående ökning och efterföljande drop-off i signal, motsvarande utarmning av den tillgängliga receptorn poolen (ca 20% minskning observerades under inspelningen perioden).
Figur 1. Schematisk av huvudmännen i FRAP vs FRAP-flip protokoll här schematiska illustrerar resultaten av en vanlig FRAP jämfört med en "FRAP-flip"-protokollet, med SEP-märkta receptorer. Fluorescens återhämtningen i traditionell FRAP visas på vänster sida. Mätt fluorescens återhämtning i den centrala ROI tillskrivs en kombination av laterala icke photobleached diffusion f september-märkta receptorer utanför photobleached ROI och insättning av receptorer genom återvinning och / eller de novo exocytos i dendritiska axeln. Däremot repetitiva photobleached av kompletterande ROI illustreras i höger sida, visar hur modifierad "FRAP-FLIP" protokollet tystnader återhämtning på grund av lateral diffusion. Som sådan kan varje uppmätt fluorescens återhämtning kan hänföras till direkt införande i ROI.
Figur 2.Insättning av SEP-GluA2 i plasmamembranet på den dendritiska skaft
A) En hippocampus neuron som uttrycker SEP-GluA2, selektivt photobleached längs en region av dendrit. Den schematiska illustrerar området av dendritliknande som har avbildats, medan den övre vänstra panelen belyser ROI som har valts för fotoblekning. Den stora vita inramade området var blekt en gång, följt av upprepad blekning av de flankerande inramade regionerna markerade med dubbla leds blå pilar. Denna panel visar dendritliknande före fotoblekning. Den röda pilen visar den uppmätta ROI, som visas i hög förstoring i de lägre panelerna. B) visar fluorescensintensiteten i den uppmätta ROI över tidsförloppet för experimentet, plottad som grånivå i ROI (ej normaliserat). Den svarta pilen markerar den tidpunkt av den initiala photobleach och grön pil anger början av den repetitiva fotoblekning. AF indikerar tee ökning i fluorescens observerades under återhämtningsperioden, på grund av insättning av SEP-GluA2 i dendritiska skaft. Efterföljande lågt pH och pH 7,4 + NH 4 Cl tvättar bekräftar att den återvunna fluorescensen avser ytuttryckta receptorer.
Figur 3. Återvinning och lateral diffusion vs Återvinning av SEP-GluK2 på dendritiska axeln efter cyklohexamid behandling
A) En hippocampus neuron uttrycker SEP-GluK2 selektivt photobleached med parallell FRAP och "FRAP-flip" protokoll för återvinning utföras längs separata dendritiska ROI. Denna neuron var föremål för förbehandling med cyklohexamid, för att blockera proteinsyntes (2 h vid 200 | ig / ml). Den schematiska illustrerar området av dendritliknande som har avbildats, medan den vänstra panelen belyser ROI som har valts för fotoblekning. The stora vita inramade området var blekt en gång, följt av upprepad blekning av de flankerande inramade regionerna i nedre dendritliknande endast markerad med dubbla leds blå pilar. Denna panel visar dendriterna före fotoblekning. Röda pilarna markera ROI som visas i hög förstoring i B) illustrerar fluorescensen återhämtningen i traditionell FRAP kontra "FRAP-FLIP" protokollet. Jämförelser av nivåer av fluorescens-intensiteten i det sena stadiet av återhämtning (tredje panelerna) visar bidraget av diffusion i sidled och återvinning jämfört återvinning enbart. C) visar fluorescensintensiteten i den uppmätta ROI över tidsförloppet för experimentet, plottad som normaliserad intensitet värden. Den svarta pilen markerar den tidpunkt av den initiala photobleach och grön pil anger början av den repetitiva fotoblekning. AF REC indikerar transienta återvändande på grund av receptor återvinning, bestäms från FRAP / FLIP Dendrite när AFdiff mäter bidrag lateral diffusion av SEP-GluK2 i dendritiska axeln i "FRAP bara" ROI. Den övergående ökningen följs av en gradvis nedgång i signal, motsvarande avställning av tillgängliga receptorer som en följd av cyklohexamid behandling. Den efterföljande lågt pH och pH 7,4 + NH 4 Cl tvättar bekräftar att den återvunna fluorescensen avser ytuttryckta receptorer.
Discussion
Vi beskriver en innovativ strategi för att visualisera delar av plasmamembranprotein människohandel. Den kombinatoriska tillvägagångssätt fotoblekning tekniker med SEP-märkt protein gör att selektivt plasmamembran införande händelser som ska bedömas. Genom att kontinuerligt fotoblekning membranproteinerna i flankerande regioner under återhämtningen, bedömer "FRAP-FLIP-metoden bidrag vesikulär människohandel fluorescens återhämtning. Denna nya metod möjliggör direkt inspelning av protein membran insättning, så både antalet underavdelningar där återvinningen observeras och amplituden i återhämtningen (AF) vid steady state skall bestämmas. Vidare medger jämförelse av FRAP med och utan FLIP andelen återhämtningen beror på lateral diffusion beräknas.
Dessutom, i samma experiment, kan regioner av icke-photobleached dendrit intill de flankerande regionerna photobleached varakvalitativt utvärderas under återhämtningen, fluorescensen förlust observerades i dessa regioner kommer att bero på lateral diffusion av photobleached receptorer i dessa icke-photobleached delar av dendritliknande.
Denna selektiva fotoblekning protokollet kan användas för att undersöka en rad olika cellulära människohandel processer såsom karakterisering excocytosis i plasmamembranet i definierade delområdena (till exempel dendriter eller ryggar) eller att bedöma bidrag lateral diffusion vs insättning genom att genomföra parallella FRAP och 'FRAP -flip "protokoll längs intilliggande dendriter (Fig. 3).
Klart, medan särskilda riktlinjer har lagts fram, kommer varje labb att behöva optimera imaging parametrar som enligt särskilda prover och utrustning. Viktigt är att alla ytreceptorer i ROI behöver vara photobleached, oberoende av z-axeln fokalplanet, men utan signifikant fototoxisk skada eller icke-specifik fotoblekning. OssERS bör iaktta försiktighet när man försöker detta protokoll i cellen Soma, som den höga andelen relativt lågt pH intracellulära fack typiskt resulterar i hög bakgrundsfluorescens i dessa regioner. Dessutom samtidigt som vi har visat hur denna teknik kan tillämpas på varierar sätt innan de börjar selektiva fotoblekningsfrekvenser experiment på ett nytt SEP-märkt konstruktion, rekommenderar vi att en första karakterisering av de märkta receptorer först genomförs, som beskrivs av Ashby et al 2.
Sammantaget är denna metod en kraftfull och mångsidig anpassning av standarden FRAP, vilket möjliggör införande händelser i plasmamembranet som skall utvärderas i nära realtid.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Wellcome Trust och Europeiska forskningsrådet för ekonomiskt stöd. IMGG är en EMBO Fellows. KLH är ett BBSRC finansierad doktorand. Vi tackar Philip Rubin och Patrick Tidball för tekniskt och cellodling stöd och Dr Andrew Doherty för underhåll och stöd med mikroskop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24mm glass coverslips | VWR international | 631-0161 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | 1mg/ml in borate buffer to coat coverslips |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 2% in neuronal plating and feeding medium |
| Penicillin Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 1% in neuronal plating and feeding medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 2mM / 0.8mM in plating/feeding medium |
| Horse Serum | Biosera | DH-291H | 10% in neuronal plating media only |
| pSIN ReP5 cloning vector | Invitrogen | K75001 | For Sindbis virus production |
| LSM510 META confocal system | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Image J Software | National Institutes of Health | open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/ |
References
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).
- Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion. Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).
- Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges. IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).
- Ashby, M. C. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).
- Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane. J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).
- Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology. J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).
- Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons. J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).
- Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines. J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).
