Summary
Embriyonik ve yenidoğan farelerde Ölçme sol ventrikül basıncı (LV) tarif edilir. Basınç ultrason eşliğinde LV içine bir sıvı dolu transdüktörüne bağlı bir iğne sokarak ölçülür. Bakım deneysel protokol sırasında normal kalp fonksiyonları korumak için alınması gerekir.
Abstract
Kan basıncı omurgalı hayvanlarda embriyonik ve postnatal gelişim sırasında önemli ölçüde artırır. Fare, kan akışı embriyonik gün (E) 8,5 1 etrafında birinci bulgulanabilir. Sistolik sol ventrikül (LV) basınç E9.5 az 2 mmHg ve E14.5 2 11 mmHg. Kaburga ve deri tam gelişmiş değil çünkü bu orta embriyonik aşamalarında, LV invaziv basınç ölçümleri için göğüs duvarına doğru olduğu açıkça görülebilir. E14.5 ve doğum (yaklaşık E21) arasındaki görüntüleme yöntemleri LV görüntülemek için kullanılmalıdır. 35 3 - postnatal gün (P) 2 ila 70 mmHg - Doğumdan sonra, 30 arteriyel basınç artar anlamına gelir. P20 ötesinde, kan basıncı solid-state kateterler (yani Millar veya Scisense) ile ölçülebilir. Özel sıvı dolu basınç dönüştürücüler 3 veya cam mikropipetler att bağlı plastik kateterler çekti ile P20 önce, bu kateterler fare arterler ve kan basıncı geliştirmek için çok büyük ölçülmelidirservo boş basınç dönüştürücüler 4 ağrıyordu.
Bizim son çalışma kan basıncı en büyük artış 5-7 farelerde erken postnatal döneme geç embriyonik sırasında oluşur göstermiştir. Kan basıncında Bu büyük artış gelişmekte olan arterlerde düz kas hücresi (SMC) fenotipi etkileyen ve önemli mechanotransduction olayları tetikleyebilir. Gelişmekte olan arterlerin mekanik özellikleri dışı matriks proteinleri (örneğin Marfan Sendromu 8 ve Supravalvüler Aort darlığı 9) kusurlar olarak bağdaştırılır insan hastalığı, bu dönemde kan basıncında hızlı değişiklikler mechanotransduction değişiklikler yoluyla hastalık fenotipi ve şiddetine katkıda bulunabilir sinyalleri. Bu nedenle, insan hastalık fare modellerinde geç embriyonik ve yenidoğan döneminde kan basıncı değişiklikleri ölçmek için edebilmek önemlidir.
Biz geç ölçüm LV basınç için bir yöntem tarifembriyonik (E18) ve postnatal (P1 - 20) fareler. Bir sıvı dolu bir basınç transdüktörüne bağlı bir iğne ultrason eşliğinde LV sokulur. Bakım özellikle embriyonik fareler için, deneysel protokol sırasında normal kalp fonksiyonları korumak için alınır. Temsilcisi veriler sunulmuş ve protokol sınırlamaları tartışılmıştır.
Protocol
1. Ultrason ve basınç sistemi
- Üretici talimatlarına (VEVO 770, Visualsonics) göre ultrason sistemi başlatın. Saf su ile ve ultrason sistemi bağlanmak - Uygun prob (P7 = modeli 708, yaş> P7 = modeli 707B yaş E18) doldurun. LV apeks enjeksiyon kolu işaret etti, böylece görüntüleme platformu üzerine monte edilmiş bir fare için bir LV uzun eksen görünümü elde etmek için gerekli yaklaşık yöneltme de ayarlanabilir stand probu yerleştirin.
- Basınç sistemi bir sıvı dolu basınç dönüştürücü, köprü amplifikatör, veri toplama sistemi ve veri kayıt yazılımı (LabChart) oluşur. Bağlantıları, üç yollu stopcocks, boru, luer kilitler ve hortum barbuslar oluşur. Bir 20 mL şırınga bir ucunda fışkırtma için% 10 heparinize tuzlu su ile doldurulur. Diğer ucu bir iğne bağlanır ve bir 3 mL şırınga gövdesi enjeksiyon kolu (Şekil 1) iğne boru tutmak için bir mahfaza olarak kullanılmak üzere modifiye edilir.
- Ultrason sisteminin enjeksiyon kolunda iğne tüp ve kasa takın. Görüntüleme platformu yaklaşık yükseklikte bir halka standında basınç dönüştürücü Kelepçe. Iğne hortuma - fare yaş (P3 = 30G, yaş> P3 = 25G yaş E18) için uygun bir iğne takın. Daha küçük iğneler kolay, göğüs duvarı ile ilerlemek ve daha yavaş bir tepki süresine sahip olan daha zordur tıkanmış olsun. Bu nedenle, LV lümen sığan büyük iğne boyutu her yaş için kullanılır.
- Görüntüleme platform üzerinde ultrason jeli bir tümsek yerleştirin ve dikkatli bir iğne görüntüleme prob (Şekil 2) ile merkezi altında jel içine doğrudan ileri edilebilir, böylece ayarlanabilir stand kullanılarak prob hizaya. İğne yeterince prob altında olmalıdır Delmeyiniz sonda kapağı, ama sonda odak derinliği içinde olması yeterince yakın. Gerekirse bu th kalır, böylece iğne elle bükülerek edilebilironun seyahat boyunca e doğru düzlemi.
- Hizalama bakımı, iğne geri çekin ve görüntüleme platformu üzerinde bir fare yerleştirmek için görüntüleme probu yükseltmek. Ucu girmiş olabilir herhangi bir jel ortadan kaldırmak için iğne yıkayın.
2. Fare hazırlığı
- Bu protokolde gösterilen tüm yöntemler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. % 1.5 izofluran sürekli Solunduğunda - zamanlanmış bir hamile anne (E18) veya neonatal fare (20 P1) uyutmak. Boru erken bir doğan fare (- 15 P1) küçük bir kafa barındırmak için standart bir burun koni içine sokulabilmektedir.
- LV apeks enjeksiyon kolu doğru bakacak şekilde dorsal dekübit pozisyonunda ultrason sistemi görüntüleme platformu için fareyi sabitleyin. Hamileler için, ekli EKG dedektör ile kalp atışlarının izlenmesi ve vücut ısısının geri bildirim kontrolü için rektal termometre eklemek için ultrason jeli tatbik edin. Yenidoğan farelerde çok küçük fveya bu dedektörler, bu nedenle kalp hızı basıncı ölçümleri sırasında izlenir ve vücut sıcaklığı harici bir ısı lambası ile korunur.
- Tüy dökücü krem ile genç fare hamile anne veya göğüs karın saç çıkarın. Yenidoğan farelerde (P1 - 10) herhangi bir epilasyon gerekmez.
- Hamileler için, diseksiyon makas ve kavisli bir forseps kullanarak karın kesip açmak. Gazlı bez, bir uterin boynuz ve yerine ılık tuzlu su çözeltisi ile nemlendirilmiş yansıtmak. Dikkatle ultrason probu ile LV bir parasternal uzun eksenden elde etmek için uygun pozisyona bir embriyo işleyebilirsiniz. Diğer uterin boynuz uygulamadan önce bu taraftaki her embriyolarda basıncını ölçün. Tüm embriyolar ve ılık serum fizyolojik periyodik Ayrıca nemli annenin karın tutun.
3. Basınç ölçme
- Yer embriyonik veya yenidoğan fare, vakum gazından arındırılmış ultrason jeli ısıtması. D olmamıştır Yenidoğan farelerdeepilasyon kalan ultrason jel kuplaj geliştirmek için uygulanmadan önce bunların göğüs üzerine ovma ultrason jel küçük bir miktar olmalıdır. Görüntüleme probu indirin ve optimal LV parasternal uzun eksen görünümü elde etmek için görüntüleme platformu açısını ayarlayın. İğnenin hizasını kaybolur, çünkü prob açısını ayarlamak etmeyin.
- Ultrason ekranında AG görüntüyü izlerken bu probun altına yakın olana kadar yavaş yavaş iğne ilerlemek. Hizalama vardiya düzeltmek için, gerekirse, iğne ve prob konumunu ayarlayın. Yavaşça salinle iğne yıkayın. Kayıt basınç veri başlatın ve LabChart yazılımı ile basınç dönüştürücü sıfır. Transdüktör sıcaklık ve konum ile sürükleniyor, bu nedenle her bir farenin basınç ölçümünden önce sadece sıfıra önemlidir.
- Yavaş yavaş ultrason görüntüsünü kenarında görülebilir kadar iğne ilerlemek, ama henüz SV. İğne konumunu ayarlamak, gerektiği takdirde, at LV girmekapeks. İğne net bir görüntü sağlamak için prob pozisyonu, gerektiği takdirde, ayarlayın. Basıncı verilerin kayıt ve ultrason görüntüsü iğne konumu izlerken, LV lümen (Şekil 3) içine iğne ilerletin. Basınç dönüştürücü gelen pulsatil kayıtların başlangıç LV lümen (Şekil 4) içindeki konumunu teyit etmektedir.
- Iğne LV lümeninde gibi görünen, ama bir basınç artışı (yaklaşık 5 - 10 uL hacmi) tespit edildiğinde sadece kadar basınç kayıtları, şırınga pistonu hafif bir musluk ile aynı hizada pulsatil değilseniz. Bu doğru bir okuma engelliyor olabilir herhangi bir takunya temizlemek gerekir. Basıncı okumaları hala pulsatil değilseniz, iğne doğru düzlem üzerinde veya altında olabilir ve LV lümenine eklenemez. Yine tuzlu ve avans ile yıkayın, iğne geri çekin. Pulsatil okumalar hala elde değilse, sonraki fare geçmek. Her fare için yeni bir iğne kullanın.
- Başarılı bir basınç değerleri% 75 elde edilebilirembriyonik ve yenidoğan farelerde denedi. Okumalar 5 almalıdır - kalp hızları beklenen önemli ölçüde farklı ise, her 10 dakika ve bir fare için basınç verilerine dahil edilmemelidir (Şekil 5A). Kalp hızı kardiyovasküler önlemler üzerinde önemli bir etkiye sahiptir ve bozulmuş kalp hızı kalp sıkıntının göstergesidir. Embriyonik sıkıntı genellikle 1 oluşur - 1.5 saat rahim ilk dışsallaştırılmasını sonra, yani hızı bütün çöp baskıları ölçmek için önemlidir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Tüm sonuçlar gösterilmiştir C57BL6J fareler için bulunmaktadır. Şekil 3'te gösterildiği gibi bir P1 fare LV lümendeki iğnenin bir görüntüsüdür. Iğne göğüs duvarı için gerekli ve küçük LV lümen erişmek, ancak önemli ölçüde basınç sisteminin tepki süresi artar. Basınçta yaklaşık bir adım artış elle sistemi uygulandığında, maksimum basınç% 67 ulaşmak için 0,067 kez se olduğuSadece (basıncı adım uygulamak için gerçek zaman büyük olasılıkla gösterge) boru ile c, bir 30 G iğne ile bir 25 G iğne ve 0,529 sec ile 0,105 san. Maksimum basınç ulaşmada gecikme Şekil 4A ve 4C gösterilen tam iz görülebilir. Tepki süresi 30G iğne ile daha yavaş olmasına rağmen kalp hızı farelerde 5 yaş ile artar, çünkü dalga daha iyi, embriyonik ve erken neonatal aşamada yakalanır. Bu sınırlamaya rağmen, sistolik basınç gerçek LV diyastolik (en az) basıncı sıfır varsayılarak hesaplanır ve sistolik (maksimum) LV basınç iki kez kararlı durumda okumaları (Şekil 4B ve 4D tespit ortalama LV basıncı edilebilir ) 6. Genellikle sol ventrikül sistolik ve ortalama arter basınçları eşit olduğu varsayılır. E18 ve P14 arasında çeşitli yaş için kalp hızları ölçülen ve hesaplanan sol ventrikül basınçları Şekil 5'te gösterilmiştir.
Şekil 1. Ekli üç yollu stopcocks, erkek (M) ve kadın (F) Luer kilit bağlantıları, hortum barbuslar, tüp, şırınga ve iğne ile basınç dönüştürücü resmi.
Şekil 2. Resmi görüntüleme probu (A) ile iğne hizalamak için kurulmuştur. Görüntüleme platformu farenin sol ventrikül apeks enjeksiyon kol bakacak şekilde döndürülür. Prob, bir LV uzun ekseni görüntü elde etmek için gerekli olan yaklaşık yönü de ayarlanabilir stand monte edilir. İğne boru gövdesi püskürtme kolu içinde monte edilmiştir. İğne görüntüleme prob (B) göre düzgün bir açısı ve dikey ve yatay konumunu belirlemek için görüntüleme platform üzerinde ultrason jeli bir tümsek içine ilerletilir.
Şekil 3. Iğne (N) Görüntü göğüs duvarı (CW) ile gelişmiş veP1 fare LV lümenine. Ölçek çubuğu = 0,1 mm.
Şekil 4. Iğnenin bir E18 (A) ve P14 (C) fare LV girer olarak Örnek pulsatil basınç okuma. Iğne takılı olan sistem tepki süresi nedeniyle kararlı bir duruma ulaşan bir gecikme var. Kararlı durumda okumaların zoom kez B ve asgari E18 LV basınçları sıfıra yakın olduğunu D. Not gösterilir, ancak sıfırdan maksimum basınç tam dalga P14 farelerin yüksek kalp hızına kaydedilemez. Ortalama basınçlar kararlı okumalarından ölçülür ve sol ventrikül sistolik basıncı = 2 x ölçülen basınç anlamına varsayılır.
Şekil 5. Ölçülen kalp hızı (A) ve (B) E18 için hesaplanan LV sistolik basıncı -. P14 fareler. N P3 P1, 22 için E18, 5 = 7, P14 için P7 için 23 ve 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokolü geç embriyonik ve erken Neonatal farelerde LV basıncı ölçmek için bir yöntem sağlar. Bu protokolün ana sınırlama basınç sisteminin zamansal çözünürlük. Bu dönüştürücü iğne ile LV gelen seyahat ve sadece basınç değerleri kaydedilebilir ortalama olarak basınç sinyali sönümlü edilir. Sönümleme mümkün olan en geniş iğne kullanılarak minimize edilebilir, ancak iğne farklı yaşlı farelerde için LV lümen içinde sığması gerekir. Diastolik basınç sıfır olarak yaklaşılabilir Çünkü, AG ve dolayısıyla arteriyel sistolik basınç ortalama LV basıncı ölçümleri hesaplanabilir. Ek arter değişkenler (yani nabız basıncı) ideal olacaktır rağmen, sistolik basınç fare gelişimi sırasında kalp ve kardiyovasküler sistem üzerine uygulanan kuvvetler hakkında değerli bilgiler sağlar. Bu protokolün faydaları yüksek throughpu için kolaylık, hız ve ölçümlerin tekrarlanabilirliği vardırçeşitli fare genotipleri veya tedavi protokolleri t karşılaştırılması. Kritik gelişim aşamalarında sistolik basıncı ölçerek, biz mekanik güçleri ve insanlara hastalık sonucu kalp ve damar yapısı ve fonksiyonu arasındaki etkileşimi anlamaya başlayabiliriz.
Solid-state kateterler basınç ölçümleri için altın standart olarak kabul ve sıvı dolu dönüştürücüler ile karşılaştırıldığında üstün zamansal çözünürlüğe sahiptir. Solid-state fare kateterler için standart ölçülerde 1.0f (0.33 mm, Millar), 1.2F (0.4 mm, Scisense) veya 1.4F (0.47 mm, Millar) vardır. Biz 1.2F Scisense kateter ve 1.4F Millar kateter ile P30 fareler ile P21 daha yaşlı farelerde iyi kan basıncı okumaları edinin. Biz P14 farelerde 1.0f Millar kateter denedi, ama tutarlı arter basıncı okumaları alamadım. P21 farelerde, bir 1.2F Scisense kateterden kan basınçları ile LV sistolik basınç ölçümleri karşılaştırıldı. Hesaplanan LV sistolik kantüm fareler için basıncı (67 ± 5 mmHg) sistolik kan basıncı (87 ± 9 mmHg) daha tutarlı düşüktü ve çok katı hal kateter ile ölçülen ortalama arter basıncı (65 ± 8 mmHg) yakın, ancak her iki kateter genotipleri 5 arasında önemli farklılıklar tespit edilmiştir. Bu nedenle, sadece E18 için P20 fareler için açıklanan LV basıncı yöntemi öneririz. Pulled-plastik kateterler sıvı dolu basınç dönüştürücüler bağlı ve kan basıncı ölçümleri 3'ü edinme karotis arter yoluyla gelişmiş olabilir. Ancak, bu sistem hala sadece kayıtları basıncı ölçümleri ortalama ve elimizi daha fazla zaman alıcı olduğunu ve LV basıncı ölçümleri burada sunulan daha yüksek bir başarısızlık oranı vardı. Servo boş basınç sistemleri (Dünya Hassas Aletler), küçük baskılar ölçümü için daha yüksek çözünürlüğe sahip ve daha iyi temporal çözünürlük 4 var. Ancak, servo boş sistemleri genellikle iletken olmayan mikropipetler, gl gerektirirass, yaşlı farelerin göğüs duvarı ilerlemiştir edilemez ölçüm sitesine yerleştirmek için.
Uyanık farelere bu basıncı ölçümleri ekstrapolasyon zaman anestezik etkileri dikkate alınmalıdır. Bu izofluran kardiyovasküler etkiler 10 minimize etmek için en iyi seçimdir ve tüm fareler aynı yöntemi ile anestezi ise, farklı gruplar arasındaki karşılaştırmalar geçerli olacağı gösterilmiştir. Embriyonik ve yenidoğan farelerde standart EKG ve görüntüleme platformu üzerinde sıcaklık probları için çok küçük. Kalp hızı basınç kayıtları ve ultrason ekranında yenerek LV görselleştirme tarafından izlenmesi gerekir. Çok yavaş kalp hızları gösteren herhangi bir farelerde kalp tehlikede olabilir ve basınç analizi dahil edilmemelidir. Fareler sıcak tutulmalı ve embriyonik farelerin deney protokolünde boyunca nemli tutulmalıdır. Diğer araştırmacılar ılık fizyolojik SALIN içinde embriyoların yaşamalarını yöntem geliştirilmiştirgörüntüleme süresi 11 boyunca e, ama biz bir ısı lambası ve ılık serum fizyolojik düzenli uygulaması kısa deneysel dönemde beklenen kalp hızı ile birlikte sağlıklı embriyolar sürdürmek için yeterli olduğunu bulduk. Maruz kalma süresi uzun yaklaşık bir saat tutulur olarak, ölçülen ilk ve son embriyo arasında önemli farklılıklar gözlenmez, ancak ölçümler bütün bir çöp hakkında veri toplamak için hızlı olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe HL087653 ve HL105314 tarafından kısmen finanse edildi. Bazı yöntemler Tıp Washington Üniversitesi Okulu'nda Robert Mecham laboratuvarında geliştirildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High resolution ultrasound system | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | Or other appropriate ultrasound system |
| High frequency ultrasound probes | VisualSonics, inc. | 708 and 707B | |
| Imaging platform and injection arm | VisualSonics, inc. | Imaging Station 2 | With ECG and temperature feedback control of platform |
| Pressure transducer | ADInstruments | MLT 844 | |
| Bridge amplifier | ADInstruments | ML221 | |
| Data acquisition system | ADInstruments | ML866 | |
| Data recording software | ADInstruments | LabChart | |
| Ring stand and clamp | Various | To hold pressure transducer during measurements | |
| 3-way stopcocks with luer connections, male lock | Cole-Parmer | 30600-02 | |
| 1/16" ID Tygon Tubing | Cole-Parmer | 06408 | |
| Male and female luers w/ 1/16" hose barb | Cole-Parmer | 45510-50 45510-00 | |
| 24" tubing with male and female luer at each end | Cole-Parmer | 30600-60 | |
| 3 and 10 mL syringes | BD Biosciences | ||
| 30 and 25G needles | BD Biosciences | 1.5 inches in length | |
| Big Ben manometer | Riester | 1456-100 | |
| Saline | Various | ||
| Heparin | Various | ||
| Ultrasound gel | Parker Hannifin Corporation | Aquasonic 100 | |
| Hair remover lotion | Nair |
References
- Ji, R. P. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ. Res. 92 (2), 133-135 (2003).
- Ishiwata, T., Nakazawa, M., Pu, W. T., Tevosian, S. G., Izumo, S. Developmental changes in ventricular diastolic function correlate with changes in ventricular myoarchitecture in normal mouse embryos. Circ. Res. 93 (9), 857-865 (2003).
- Huang, Y., Guo, X., Kassab, G. S. Axial nonuniformity of geometric and mechanical properties of mouse aorta is increased during postnatal growth. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 290 (2), H657-H664 (2006).
- Ishii, T., Kuwaki, T., Masuda, Y., Fukuda, Y. Postnatal development of blood pressure and baroreflex in mice. Auton. Neurosci. 94 (1-2), 34-41 (2001).
- Le, V. P., Knutsen, R. H., Mecham, R. P., Wagenseil, J. E. Decreased aortic diameter and compliance precedes blood pressure increases in postnatal development of elastin-insufficient mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2011).
- Wagenseil, J. E. Reduced vessel elasticity alters cardiovascular structure and function in newborn mice. Circ. Res. 104 (10), 1217-1224 (2009).
- Wagenseil, J. E. The importance of elastin to aortic development in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (2), H257-H264 (2010).
- Ramirez, F., Sakai, L. Y., Rifkin, D. B., Dietz, H. C. Extracellular microfibrils in development and disease. Cell. Mol. Life Sci. 64 (18), 2437-2446 (2007).
- Li, D. Y. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum. Mol. Genet. 6 (7), 1021-1028 (1997).
- Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Jr Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60 (1), 14-21 (2006).
