Summary
विधि है जिसके द्वारा हवाई कट दुम व्यंग्य प्रक्रिया की रूपरेखा,
Protocol
1. बैक्टीरियल Inocula की तैयारी
- 0 दिन
दो व्यंग्य टीका, प्लेट एलबीएस पर प्रासंगिक जीवाणु उपभेदों 13 अगर पहले दिन. - 25-28 ° रात भर सी बैक्टीरिया को सेते हैं.
- 1 दिन
प्रत्येक वी. की एक कॉलोनी के साथ एक गिलास संस्कृति ट्यूब में 3 मिलीलीटर मध्यम एलबीएस टीका लगाना fischeri संक्रमण के लिए तनाव. बैकअप के रूप में ट्यूबों की नकल तैयार करते हैं. - 2 दिन
(बैक्टीरियल कदम व्यंग्य 3.7-3.10 कदम के साथ 1.4-1.6 समन्वय)
1 टीका करने के लिए पहले घंटे, उपसंस्कृति बैक्टीरिया 3 कांच संस्कृति ट्यूब में मिलीलीटर एलबीएस में (37.5 μl) 1:80 और वातन साथ 1 घंटे के लिए हो जाना. - नमूना के 600 आयुध डिपो टीका करने के लिए पहले उपाय. ठेठ माप 0.3-0.6 तनाव पर निर्भर कर रहे हैं.
- Inoculum (μl) मात्रा = / 1.25 आयुध डिपो 60: 3-5 एक्स का लक्ष्य inoculum के लिए 10 3 CFU / एमएल inoculum के रूप में की मात्रा की गणना0 (उदाहरण के लिए, = 600 आयुध डिपो के लिए 0.5, परिकलित inoculum = मात्रा 1.25/0.5 के एक = 2.5 μl). यह राशि सीधे 4.1 चरण में विद्रूप युक्त समुद्री पानी के लिए जोड़ा जाता है. इस गणना के लिए वी. के विभिन्न प्रकारों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है fischeri या यहाँ निर्दिष्ट की तुलना में कम या उच्च स्तर पर टीका के लिए.
2. अगर प्लेट्स के Inocula की गणन के लिए तैयार
- प्रत्येक उपचार के लिए, लेबल 4.1 चरण में inoculum की थाली के नमूने एलबीएस प्लेट (2 उपचार के प्रति).
- 5 प्लेट प्रति बाँझ चढ़ाना मोती जोड़ें.
3. व्यंग्य किशोरों का संग्रह
- उपाय तुरंत refractometer का उपयोग महासागर की लवणता और 35 ‰ समायोजित.
- 1 तुरंत निस्पंदन इकाई का उपयोग और एक संलग्न निर्वात लाइन या वैक्यूम पंप, फिल्टर निष्फल तुरंत महासागर (FSIO) के उत्पन्न महासागर के एल फ़िल्टर. सख्ती प्रत्येक वितरण से पहले घूमता द्वारा पानी आक्सीजन के साथ मिलना. गुई फिल्टर यूनिट 2 दिनों के लिए reused किया जा सकता है.
- दो (2) डिस्पोजेबल नमूना कटोरे में से प्रत्येक में FSIO के 40-50 मिलीलीटर अशेष भाजक. Earlies के रूप में और एक timelies के रूप में लेबल.
- विंदुक टिप से लगभग 1 सेमी, ऊपर न्यूनतम लकीरें (देखें चित्र 3) काटने से किशोर व्यंग्य प्राप्त करने के लिए तैयार प्लास्टिक स्थानांतरण pipettes की एक अतिरिक्त. यह एक व्यापक क्षेत्र है जिसके माध्यम से व्यंग्य संग्रह पर पारित कर सकते हैं सुविधा. त्यागें किसी भी हस्तांतरण pipettes जिसमें किसी न किसी सतह के संपर्क में है.
- तैयार हस्तांतरण pipettes का प्रयोग, ई. इकट्ठा scolopes कि रातोंरात रची और earlies FSIO का कटोरा को हस्तांतरण. जल्दी hatchlings अंडा प्रणाली में 1 से अधिक घंटे के लिए किया गया है और contaminating के द्वारा उपनिवेशण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं वी. अंडा प्रणाली में fischeri. Earlies संवेदनशील बसाना प्रयोगों के लिए उपयोग नहीं है.
- अंडा टैंक नई hatchlings के लिए हर 30-45 मिनट की जाँच करें. सुनिश्चित करें कि सभी hatchlings प्रत्येक ग के दौरान मंजूरी दे दी हैबिल्ली. एक हस्तांतरण पिपेट, timelies FSIO का कटोरा में और जमा के साथ hatchlings निकालें. एक समय पर फैशन में एकत्र पशु बसाना प्रयोगों के लिए उपलब्ध हैं.
- जब संग्रह समाप्त हो गया है (~ 45 मिनट की शाम के बाद), मुख्य प्रयोगशाला व्यंग्य हस्तांतरण. Empirically यह 3 घंटे inoculations के लिए निर्बाध प्रयोगशाला प्रकाश की शर्तों के तहत पशुओं को उपनिवेश के लिए फायदेमंद है.
- प्रत्येक उपचार के लिए, 40 मिलीलीटर FSIO है के साथ एक कटोरा तैयार. परख के लिए कटोरे के लिए विद्रूप जोड़ें (अधिकतम पता = 40 प्रति कटोरा).
- तैयार एक aposymbiotic नियंत्रण (नकारात्मक) के रूप में एक अतिरिक्त कटोरा.
- प्रत्येक उपचार के लिए एक समर्पित हस्तांतरण विंदुक तैयार.
- 2% इथेनॉल में अतिरिक्त विद्रूप Euthanize के.
4. व्यंग्य औपनिवेशीकरण
- दिन 2 - का उपयोग एक P10 Pipetman के, प्रत्येक व्यंग्य कटोरा (3.8 चरण) में प्रत्येक उपचार के लिए बैक्टीरिया की गणना अशेष भाजक (1.5 चरण) के बग़ैर. 3 घंटे टाइमर शुरू के तुरंत बादपहला टीका.
- प्रत्येक उपचार के लिए, कटोरा के किनारे के पास विंदुक रखने और pipetting और नीचे बार - बार लगभग 10 सेकंड के लिए पानी और व्यंग्य का मिश्रण द्वारा समर्पित हस्तांतरण विंदुक के साथ कटोरा में "भंवर" पैदा करते हैं. मिश्रण पूरी तरह से महत्वपूर्ण है.
- प्लेट 2.2 चरण से एलबीएस अगर प्लेट पर एक कटोरा से 50 μl (तकनीकी के लिए प्रतिकृति, प्लेट 50 प्रति दो इलाज μl प्लेट). 25-28 ° रात भर सी सेते हैं.
- प्रत्येक उपचार के लिए तैयार धोने के कटोरे (100 मिलीलीटर FSIO ea /).
- प्रत्येक व्यंग्य के लिए है ड्रोसोफिला शीशियों (4 मिलीलीटर FSIO ea /) तैयार करें.
- वास्तव में 3 घंटे के बाद, उनके संबंधित धोने के कटोरे (सभी उपचार के लिए पूर्ण) के लिए व्यंग्य का हस्तांतरण. यह टीका बंद हो जाता है.
- आगे बढ़ना के लिए FSIO साथ अपने स्वयं के ड्रोसोफिला शीशी प्रत्येक व्यक्ति व्यंग्य हस्तांतरण. प्रत्येक उपचार के लिए नामित हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करें.
- व्यंग्य सुविधा ड्रोसोफिला शीशियों की ट्रे ले जाएँ दिन n / वापसight प्रकाश चक्र के जानवरों embryogenesis दौरान अनुभव किया.
- दिन 3 - प्रत्येक व्यंग्य के लिए तैयार ड्रोसोफिला शीशियों (4 मिलीलीटर FSIO ea /).
- 22-24 घंटे के बाद - टीका पर सांझ से पहले, एक नया ड्रोसोफिला शीशी प्रत्येक व्यंग्य हस्तांतरण. प्रत्येक उपचार के लिए नामित हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करें.
- दिन 4 - 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge ट्यूब (1/squid) के लेबल तैयार करते हैं.
- पहले 46-48 घंटे के बाद टीका उपाय, पर शाम तक और ड्रोसोफिला शीशी (छह एकीकरण और ढक्कन बंद करने पर स्वत: पढ़ने के लिए सेट luminometer) में प्रत्येक व्यंग्य की luminescence रिकॉर्ड.
- पृष्ठभूमि luminescence के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, FSIO साथ एक शीशी है कि किसी भी व्यंग्य को शामिल नहीं करता है उपाय.
- लगभग 700 4.12 कदम से 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge ट्यूब μl की मात्रा में प्रत्येक व्यंग्य स्थानांतरण. एक गत्ता फ्रीजर बॉक्स में ले जाएँ. एक बार ढक्कन बॉक्स पर रखा गया है, यह बैक्टीरिया निष्कासन के लिए प्रकाश संकेत के रूप में नहीं निकाल wel के नहीं हैंएल समझा.
- -80 ° रात भर सी पर microcentrifuge ट्यूब रुक.
5. औपनिवेशीकरण के स्तर का निर्धारण
- प्रत्येक व्यंग्य के लिए, 475 FSIO μl (या 70% autoclaved तुरंत महासागर) के साथ दो (2) microcentrifuge ट्यूबों, प्रत्येक के लिए तैयार हैं.
- पहले एक Kimwipe का उपयोग मूसल साफ और सकल मलबे और / या ऊतक निकालने के द्वारा pestles तैयार करते हैं.
- जगह एक 50 मिलीलीटर 95% इथेनॉल युक्त बीकर में टिप नीचे pestles. इथेनॉल लगभग 3 सेमी की ऊंचाई करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए.
- प्रत्येक पैर के लिए, बीकर से हटाने और एक Kimwipe साथ टिप पोंछे.
- डुबकी को इथेनॉल स्नान में वापस मूसल निकालने के लिए, और (ऊपर टिप) सम्मिलित एक microcentrifuge ट्यूब रैक में और लगभग 15 मिनट के लिए पूरी तरह से सूखी हवा देते हैं.
- एक microcentrifuge ट्यूब रैक में पिघलना व्यंग्य (अधिकतम n = 8).
- यदि आवश्यक हो, 700 μl मात्रा समायोजित करें.
- 5.5 कदम से एक पैर का उपयोग करना, स्याही थैली RUP तक पशु ऊतक को बाधितtures (पानी एक बदली ग्रे रंग बंद हो जाएगा).
- मूसल निकालें और यह सुनिश्चित करें सभी ऊतक ट्यूब में रहता है.
- वास्तव में 10 सेकंड (एक टाइमर का उपयोग करें) के लिए ऊतक संक्षिप्त भंवर.
- ऊतक 10 मिनट के लिए आराम करने के लिए अनुमति देते हैं. ऊतकों को व्यवस्थित करने और बैक्टीरिया और स्याही समाधान में रहते हैं. गणना का पालन करें कि बैक्टीरिया / स्याही समाधान [एक] कमजोर पड़ने (यानी ई. 700 μl में scolopes प्रकाश अंग homogenate के) है. धारावाहिक dilutions 1:20 ([बी], [सी]) नीचे वर्णित हैं.
- [बी] कमजोर पड़ने के लिए, microcentrifuge 5.1 चरण में तैयार ट्यूबों के लिए 25 μl [एक] में जोड़ें. भंवर.
- [सी] कमजोर पड़ने के लिए, 25 μl जोड़ने [बी] एक microcentrifuge 5.1 चरण में तैयार ट्यूबों के लिए. भंवर.
- प्लेट एलबीएस अगर पर प्रत्येक कमजोर पड़ने की 50 μl, 2 उपचार प्रति प्रतिकृति.
- 25-28 ° रात भर सी प्लेट सेते हैं.
6. डेटा विश्लेषण
- CFU / प्रकाश अंग (स्थानीय), देशों की गणनाप्रत्येक उपचार के लिए थाली पर टी कालोनियों में जो 10-400 कालोनियों मौजूद हैं, और उचित सूत्र का उपयोग करें:
CFU / LO = ([एक] थाली पर कालोनियों) x 14, या
CFU / LO = ([बी] थाली पर कालोनियों) x 280, या
CFU / LO = ([सी] थाली पर कालोनियों x) 5600. - व्यक्तिगत डेटा अंक और medians एक लघुगणकीय पैमाने पर साजिश है.
- डेटा अक्सर नहीं कर रहे हैं सामान्य रूप से अलग प्रसरण के साथ, वितरित और outliers जैविक सार्थक जानकारी हो सकती है. इसलिए, गैर पैरामीट्रिक परीक्षण तय है कि उपचार काफी अलग करने के लिए एक उपयोगी विधि प्रदान करते हैं.
- सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए GraphPad चश्मे सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. दो उपचार के लिए, Wilcoxon रैंक रकम परीक्षण का उपयोग करें. से अधिक दो उपचार के बीच तुलना के लिए, उपयुक्त के बाद परीक्षण के साथ Kruskal - वालिस परीक्षण का उपयोग करें.
7. प्रतिनिधि परिणाम
एक नमूना बसाना परख से परिणाम चित्रा 4 में दिखाया जाता है. के दो उपभेदों
चित्रा 1 उपनिवेशन प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट. अलग - अलग बैक्टीरिया और विद्रूप काटा जाता है, तो निर्दिष्ट inoculum में मिलाया. व्यंग्य धो रहे हैं, तो 3 घंटे, 24 घंटे, और 4 में नया पानी को हस्तांतरित 8 घंटे के बाद टीका. 48 घंटे में luminescence मापा जाता है और जानवरों जमे हुए हैं, जो कार्य करता है जानवरों सतह बाँझ. प्रकाश अंग उपनिवेश बैक्टीरिया -80 में सक्षम रहते ° C एक पिघलना (कोई अतिरिक्त चक्र फ्रीज पिघलना) के माध्यम से.
आंकड़ा प्रवाह 2. Homogenization और बैक्टीरिया के कमजोर पड़ने चढ़ाना illustrating के चार्ट. धारावाहिक 20 गुना dilutions उपनिवेश बैक्टीरिया की गणना के लिए उपयुक्त गतिशील रेंज प्रदान करते हैं.
चित्रा 3. एक उचित संकीर्ण शाफ्ट शंकु के साथ pipettes स्थानांतरण एक संकीर्ण बोर (ए) कि किशोर व्यंग्य नुकसान होगा. कैंची या एक धार के साथ सबसेसंकरेमें अनुभाग काटने pretreatment किशोर व्यंग्य स्थानांतरित करने के लिए (बी) एक उपयुक्त उपकरण पैदावार.
/ s/ftp_upload/3758/3758fig4.jpg ">
चित्रा 4 बसाना परख के लिए नमूना डेटा. (ए) inoculum कटोरे में बैक्टीरिया का स्तर. (ख) व्यक्तिगत विद्रूप की Luminescence. (सी) व्यक्तिगत विद्रूप की कालोनी में गिना जाता है. (डी) व्यक्तिगत विद्रूप की विशिष्ट luminescence. ए पी ओ, Aposymbiotic (नकारात्मक नियंत्रण uncolonized).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
बसाना वर्णित परख एक नियंत्रित पर्यावरण प्रयोगशाला में विश्लेषण के लिए एक प्राकृतिक सहजीवी प्रक्रिया की अनुमति देता है. जैसे, यह विभिन्न प्राकृतिक आइसोलेट्स द्वारा उत्परिवर्ती उपभेदों, और विभिन्न रासायनिक सरकारों के अधीन उपनिवेशण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्णित प्रयोगों पर बदलाव आमतौर सहजीवन के विभिन्न पहलुओं का आकलन किया जाता है. उपनिवेशण के कैनेटीक्स luminescence के दौरान पहले 24 घंटे, जो एक जगमगाहट काउंटर है जो संयोग डिटेक्टर हटा दिया गया है में स्वचालित रूप से पता लगाया जा सकता का परीक्षण करके मापा जा सकता है. इसके अलावा, एक दूसरे के रिश्तेदार तनाव के सापेक्ष बसाना क्षमता में एक प्रतिस्पर्धी बसाना परख द्वारा मापा जा सकता है, जिसमें पशुओं के एक सेट में दो उपभेदों का उत्पादन अनुपात इनपुट अनुपात (विशिष्ट एंटीबायोटिक प्रतिरोध के द्वारा अंतर का पता लगाने, प्रतिदीप्ति के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं , या वर्णजनीय [/ LacZ Xgal है] मार्कर). अंत में, उपनिवेशण confocal माइकर द्वारा सीधे imaged किया कर सकते हैंoscopy.
यह प्रयोगों के लिए स्वस्थ किशोर विद्रूप का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. गरीब व्यंग्य स्वास्थ्य के व्यवहार संकेतक हलकों में तैराकी (euthanize पशु), या जानवरों है कि सफेद रहते हैं और उनके एक काले सतह पर भूरे रंग बदल (देखभाल के साथ प्रयोग) chromatophores बदल नहीं शामिल हैं. के रूप में वहाँ मेजबान आबादी में भिन्नता मौजूद है, पशुओं की छोटी संख्या के साथ दोहराने के प्रयोगों की एक बड़ी संख्या अक्सर बड़े नमूना आकारों के साथ दोहराने के प्रयोगों की एक छोटी संख्या से अधिक मूल्यवान है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों व्यंग्य सुविधा समर्थन के लिए और इस पांडुलिपि पर टिप्पणी, माइकल Hadfield और क्षेत्र संग्रह के दौरान सहायता के लिए Kewalo समुद्री प्रयोगशाला, और रूबी और McFall-Ngai इस प्रोटोकॉल के लिए योगदान के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों के लिए Gyllborg Mattias धन्यवाद. मेंडल प्रयोगशाला में काम NSF के IOS 0843633 द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR international | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher Scientific | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega Corp. | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega Corp. | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster & Smith | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith | CD-16881 | Prepare at 35 ≥ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalge Nunc international | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼", lower diameter 2 ¼", height 3". Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR international | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
- Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
- Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
- Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
- Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , PACON International. Honolulu, Hawaii. (2001).
- Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
- Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
- Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).
