Früherkennung von Apoptose gefährdeten Zellpopulationen in einer Vielzahl von Krankheiten zu identifizieren. Hier zeigen wir ein Verfahren, um eine der frühen Apoptose-Detektion Protein (Annexin V) mit einem MRI-nachweisbare Eisenoxid-Nanopartikel (SPIO) zu verbinden. Diese Methode kann auch auf andere Proteine von Interesse zu MRT-nachweisbar molekulare Bildgebung Sonden erzeugen verlängert werden.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zellulärer Apoptose ist ein hervorstechendes Merkmal von vielen Krankheiten, und das den programmierten Zelltod tritt in der Regel vor der klinischen Manifestation der Erkrankung offensichtlich sind. Ein Mittel, um Apoptose in ihren frühesten, reversiblen Stadium zu erkennen wäre leisten einen vorklinischen "Fenster", in der präventiven oder therapeutischen Maßnahmen ergriffen, um das Herz vor bleibenden Schäden schützen könnte. Hier stellen wir ein einfaches und robustes Verfahren für die menschliche Annexin V (ANX), die eifrig an Zellen bindet, in den ersten, reversiblen Stadium der Apoptose, superparamagnetische Eisenoxid (SPIO)-Nanopartikel, die als MRI-Kontrastmittel nachweisbaren dienen konjugieren. Die Methode der Konjugation beginnt mit einer Oxidation der SPIO-Nanopartikel, die Carboxylgruppen oxidiert auf dem Polysaccharid Schale der SPIO. Gereinigtes ANX Protein wird dann in der Einstellung eines Natrium-Borat-Lösung, um eine kovalente Wechselwirkung mit ANX SPIO erleichtern in einer reduzierenden Puffer zugesetzt. Ein abschliessender Reduktionsschritt mit Natrium borohydridE wird durchgeführt, um die Reduktion abgeschlossen ist, und dann wird die Reaktion gestoppt. Unkonjugiertes ANX wird aus der Mischung von Mikrozentrifuge Filtration entfernt. Die Größe und Reinheit der ANX-SPIO Produkt zeichnet sich durch dynamische Lichtstreuung (DLS) verifiziert. Diese Methode erfordert keine zusätzlich oder Modifikation, das Polysaccharid SPIO-Shell, um vernetztes Eisenoxid-Partikel-Konjugation Methoden oder Biotin-markierten Nanopartikeln dagegen. Im Ergebnis stellt diese Methode einen einfachen, robusten Ansatz, der Konjugation von anderen Proteinen von Interesse verlängert werden kann.
Protokoll
Übernommen aus vorherigen Studien ein.
1. Konjugation von Annexin V SPIO
- Oxidieren SPIO Teilchen (Ocean Nanotech Inc., 5 mg / ml) für 1 Stunde bei 20 ° C im Dunkeln in Lösung mit 0,15 M Natriumchlorid (NaIO 4) (4:1 Gewicht: Gewicht-Verhältnis) 2.
- Inkubieren des oxidierten SPIO für 12 Stunden mit gereinigtem ANX Protein (im Verhältnis 1:1, Gewicht: Gewicht) in 0,15 M Natriumborat (Na 2 B 4 O 7 10H 2 O) bei 20 ° C
- Reduzieren der Mischung weiter für 1 Stunde mit Natriumborhydrid (NaBH 4) unter dem Abzug und dann Löschen mit ....
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Diskussion
Die beschriebene Methode der Konjugation zum Verbinden SPIO Annexin V nutzt die Seitenkette Amingruppen von Annexin und die Carboxylgruppen der SPIO Nanopartikel. Durch gezielte Oxidations-Reduktions-Schritte können kovalente Verknüpfung dieser Verbindungen erreicht werden, und die resultierende funktionalisierte Nanopartikel können isoliert werden. Dieses Verfahren kann verallgemeinert werden, um andere Proteine und Nanopartikel in der Umgebung.
Die wichtigsten Schritte sind die Oxidation.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).
American Heart Association (JL).
Stanford University, VPUE Grant (JL).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenz | Firma | Katalog # | |
| Superparamagnetische Eisenoxid | Ozean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG | |
| Supermag Separator | Ozean Nanotech, Inc. | N / A | |
| Zetasizer Nano DLS Maschine | Malvern, Inc | N / A |
Referenzen
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate. Biochemistry. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu,....
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Nachdrucke und Genehmigungen
