Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

L'infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

Published: March 15, 2012 doi: 10.3791/3781
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1, 1
1Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, 2Department of Medical Microbiology and Infection Control, VU University Medical Center, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Summary

Embryons de poisson zèbre transparent ont prouvé hôtes modèle utile pour visualiser et les interactions entre l'étude fonctionnellement les cellules immunitaires innées et bactéries pathogènes intracellulaires, tels que

Abstract

Poisson zèbre (Danio rerio) embryons sont de plus en plus utilisé comme un modèle pour étudier la fonction du système immunitaire des vertébrés innée dans les interactions hôte-pathogène 1. Les principaux types de cellules du système immunitaire inné, les macrophages et les neutrophiles, les développer au cours des premiers jours de l'embryogenèse avant la maturation des lymphocytes qui sont nécessaires pour les réponses immunitaires adaptatives. La facilité d'obtention de grands nombres d'embryons, leur accessibilité en raison du développement externe, la transparence optique de stades embryonnaire et larvaire, un large éventail d'outils génétiques, de vastes ressources mutantes et des collections de lignes de reporter transgéniques, tous les ajouter à la polyvalence du poisson-zèbre modèle. Salmonella enterica sérotype Typhimurium (S. typhimurium) et Mycobacterium marinum peut résider intracellulaire dans les macrophages et sont fréquemment utilisés pour étudier les interactions hôte-pathogène chez les embryons de poisson zèbre. Les processus d'infection de ces deuxdes bactéries pathogènes sont intéressants à comparer car S. infection aiguë et typhimurium est mortelle dans la journée, tandis que M. l'infection marinum est chronique et peut être imagée en place au stade larvaire 2, 3. Le site de micro-injection de bactéries dans l'embryon (Figure 1) détermine si l'infection deviendra rapidement systémique ou un premier temps restent localisées. Une infection systémique rapide peut être établie par micro-injection des bactéries directement dans la circulation sanguine via la veine caudale à l'île du sang postérieure ou via le canal de Cuvier, un canal large diffusion sur le sac vitellin reliant le cœur de la vascularisation du tronc. Au 1 dpf, lorsque les embryons à ce stade ont macrophages phagocytically actifs, mais les neutrophiles n'ont pas encore mûri, l'injection dans l'île du sang est préférable. Pour les injections à 2-3 dpf, lorsque les embryons ont également développé fonctionnels (myéloperoxydase-productrice) neutrophiles, le canal de Cuvier est préférable que tsite d'injection, il. Pour étudier la migration dirigée des cellules myéloïdes vers les infections locales, les bactéries peuvent être injectés dans le muscle queue, vésicule otique, ou rhombencéphale ventricule 4-6. En outre, la notochorde, une structure qui semble être normalement inaccessibles aux cellules myéloïdes, est très sensible à l'infection locale 7. Une alternative utile pour applications à haut débit est l'injection de bactéries dans le jaune d'embryons dans les premières heures après la fécondation 8. La combinaison de bactéries fluorescentes et les lignes de poisson-zèbre transgénique avec des macrophages ou de neutrophiles fluorescentes crée des conditions idéales pour l'imagerie multi-couleur des interactions hôte-pathogène. Cet article décrira vidéo des protocoles détaillés pour l'infection par voie intraveineuse et locale des embryons de poisson zèbre avec S. typhimurium ou M. bactéries marinum et pour l'imagerie de fluorescence ultérieure de l'interaction avec les cellules du système immunitaire inné.

Protocol

1. Préparer Aiguilles d'injection

  1. Préparer borosilicate aiguilles de verre injection microcapillaires (Harvard Apparatus, 300038, 1 mm de diamètre extérieur x 0,78 mm de diamètre) en utilisant un dispositif de traction micropipette (Sutter Instruments Inc, Flaming / Brown p-97 avec les paramètres suivants pour une plus longue pointe: 400 pression de l'air; la chaleur 610; traction 40; vitesse de 50; de 30 et avec les paramètres suivants pour une courte pointe: 500 pression de l'air, la chaleur 510; traction 100; vitesse 200; temps 60).
  2. Brisez la pointe de l'aiguille avec des pincettes fines pour obtenir un diamètre d'ouverture de pointe pm 5-10. Il est conseillé de l'ouverture conique pointe de l'aiguille à un angle de 45 degrés avec un microbroyeur (Narishige Inc, EG-400) pour donner un plus nette pointe. Cela facilitera la perforation de la couche épidermique et donc se traduire par davantage d'injections reproductibles avec moins de dommages des tissus qu'avec aiguilles émoussées. Aiguilles à pointe plus sont préférés pour veine caudale (étape 5) et conduit de Cuvier (étape 6.1) et des injections plus courtes aiguilles à boutsont préférés pour les autres protocoles d'injection (étapes 6,2-6,6).

2. Préparer S. typhimurium inoculum

  1. Plaque à S. typhimurium d'un stock -80 ° C sur le glycérol plaques d'agar LB (avec des antibiotiques appropriés pour sélectionner des vecteurs d'expression de fluorescence) et incuber une nuit à 37 ° C.
  2. Choisissez individuels colonies fluorescence positifs et les remettre en suspension à la concentration souhaitée (voir protocoles 5 et 6) dans stérile tampon phosphate salin (PBS), contenant éventuellement 0,085% (v / v) de rouge de phénol (Sigma-Aldrich) pour faciliter la visualisation de l' processus d'injection. Utiliser directement la suspension frais pour l'injection ou de préparer des stocks de glycérol. Pour préparer les stocks de glycérol, ralentit le stock d'injection fraîchement préparé à la concentration désirée de bactéries et de se concentrer le stock en remettant en suspension le culot dans la moitié du volume à partir de stériles 20% (v / v) de glycérol (Sigma-Aldrich) dans du PBS. Stocker le stock de glycérol à -80 ° C Diluer le stock de glycérol 1:1 (v / v) avant l'injection dans du PBS stérile, contenant éventuellement 0,17% rouge de phénol.
  3. Vortex la suspension bactérienne pour éviter les grumeaux.
  4. Chargez l'inoculum dans l'aiguille microcapillaire en utilisant une pointe microloader (Eppendorf, 5,242,956,003).
  5. En raison de la taille relativement importante de S. bactéries typhimurium et leur brillante Ds-ROUGE fluorescence lors de l'utilisation du vecteur d'expression pGMDs3 3 (souche disponible sur demande), individuels cellules bactériennes peuvent facilement être assimilé à un stéréomicroscope à fluorescence afin de définir la dose d'injection. À cette fin, injecter 1 nL dans une goutte de PBS sur une plaque de gélose, dénombrer les bactéries fluorescentes, et de calculer le volume d'injection qui est nécessaire pour obtenir la dose désirée bactérienne (de préférence conserver le volume d'injection entre 1-2 nL). Injecter des embryons avec S. typhimurium par l'intermédiaire de l'itinéraire sélectionné (voir protocoles 5 et 6).

3. Préparer

  1. Gardez le M. marinum pression croissante sur Difco Middlebrook 7H10 agar (BD et de l'entreprise) supplémenté avec 10% d'acide oléique-albumine-dextrose-catalase (OADC, BD et de l'entreprise), le glycérol 0,5%, et avec des antibiotiques appropriés pour sélectionner des vecteurs d'expression de fluorescence (souches disponibles sur demande 9), donc il ya toujours un stock frais.
  2. Choisissez une colonie de M. marinum et remettre en suspension dans Difco Middlebrook bouillon 7H9 (BD et de l'entreprise) supplémenté avec 10% d'albumine-dextrose-catalase (ADC, BD et de l'entreprise) et 0,05% de Tween 80 (Sigma-Aldrich) et les antibiotiques appropriés. Vérifiez que la densité optique (DO) à 600 nm est de 0,2 à 0,3 et le laisser grandir statiquement pendant une nuit à 28,5 ° C. Le temps de génération de M. marinum est d'environ 4-6 h, variant en fonction de la souche.
  3. Mesurer la DO à 600 nm à nouveau le jour des injections. Un DO600 de 1 correspond à environ 10 8 M. marinum / ml(Cela peut varier en fonction de la souche bactérienne utilisée et devrait donc être basée sur une courbe de croissance pour la souche particulière).
  4. Récolter les bactéries quand ils sont en phase logarithmique (ne laissez pas le DO600 dépasser 1,00) par centrifugation et les laver trois fois dans du PBS stérile.
  5. Mesurer la DO600 nouveau de la suspension bactérienne dans du PBS, ralentit, et remettre en suspension les bactéries à la concentration souhaitée (voir protocoles 5 et 6) dans du PBS ou dans Polyvinylpyrrolidone 2% (PVP40) dans du PBS (w / v), ce qui améliore l'homogénéité de la suspension bactérienne. Le rouge de phénol (Sigma-Aldrich) peut être ajouté à une concentration de 0,085% pour faciliter la visualisation du processus d'injection. Utiliser directement la suspension frais pour l'injection ou de préparer des stocks de glycérol. Pour préparer les stocks glycérol centrifuger le stock d'injection fraîchement préparé avec la concentration désirée de bactéries et de concentrer le stock en remettant en suspension du culot dans la moitié du volume à partir de 20% de glycérol stérile dans du PBS. Stocker le glycstock de erol à -80 ° C. Diluer le stock de glycérol 01:01 (volume / volume) dans du PBS stérile, contenant éventuellement 4% PVP40 et / ou 0,17% de rouge de phénol.

4. Préparer embryons de poisson zèbre pour préparations injectables

  1. Mettre en place de couples reproducteurs de poisson zèbre et de recueillir des embryons comme le montre dans un autre article 10 vidéo. Gardez embryons dans une boîte de Pétri remplie d'eau d'œuf (60 sels de la Mer pg / ml; 60. Ca embryons / boîte) et incuber à 28,5 ° C.
  2. Si nécessaire, ajouter 0,003% N-phénylthiourée (PTU, Sigma-Aldrich) à l'eau d'œuf lorsque les embryons sont environ 12 HPF afin de prévenir la mélanisation.
  3. Environ 24 heures après la fécondation (HPF), dechorionate les embryons avec des pincettes FINE (fine sciences Tools Inc, Dumont # 5 forceps - Biologie Inox.
  4. Conserver les embryons dans une boîte de Pétri remplie d'eau et d'oeuf avec une couche de 1% d'agarose sur le fond pour éviter embryons de coller à la surface de matière plastique.
  5. Anesthésier les embryons avec 200 ug / ml tampon 3Acide p-aminobenzoïque (tricaïne, Sigma-Aldrich) environ 10 min avant les injections.

5. L'injection intraveineuse de bactéries dans une journée embryons vieux

  1. Stade des embryons à 28 HPF 11 par la vérification de la circulation du sang compatible, en commençant de la pigmentation dans les yeux, une queue droite, et le cœur étant positionné juste ventralement à l'œil.
  2. Anesthésier les embryons, voir l'étape 4.5.
  3. Chargez l'aiguille avec l'inoculum bactérien en utilisant une pointe microloader.
  4. Montez l'aiguille chargée sur un micromanipulateur (Instrument Sutter, MM-33) relié à un support (Instruments de précision du monde, M10L support magnétique) et le positionner sous un microscope stéréo (Leica M50, achromat 1x objectif 0,15 NA, base de la lumière transmise TL ST). Réglez le temps d'injection à 0,2 s et la pression de compensation à 15 hPa (Eppendorf, FemtoJet). Régler la pression d'injection entre 700 et 900 hPa pour obtenir le volume d'injection de l'aiguilleutilisée. Ajuster la taille de la goutte en fonction du diamètre voulu à l'aide d'une barre d'échelle sur une lame de microscope ou dans l'oculaire. Pour la détermination de la taille de la goutte peut être injecté dans l'huile minérale sur une lame de microscope, ou la taille peut être estimée en injectant dans l'air, ce qui laisse la goutte suspendue sur la pointe de l'aiguille. Le rayon d'une goutte d'une nL est 0,062 mm (V = 4/3 π r 3).
  5. Réglez le micromanipulateur avec l'aiguille chargée dans la position correcte avant d'injecter (soit environ à un angle de 45 ° par rapport à la surface de la plaque d'injection) et seulement le déplacer d'avant en arrière à injecter.
  6. Les embryons sont anesthésiés à la pipette sur une plaque plane d'agarose 1% injection et de l'eau en excès est éliminé oeuf, ce qui permet la tension de surface pour contenir les embryons en place lors des injections. Utilisez un outil de boucle de cheveux (Figure 2) pour aligner les embryons. Orienter la plaque d'injection à la main lors des injections de placer des embryons dans la position préférée pour inserting de l'aiguille, c'est à dire avec leurs queues pointant vers la pointe de l'aiguille.
  7. Placez le bout de l'aiguille directement au-dessus de la clôture veine caudale à l'ouverture uro-génital (figure 1A), percer le périderme avec le bout de l'aiguille et injecter la dose voulue de bactéries, nous utilisons environ. 250 UFC de S. typhimurium de type sauvage (wt) souche SL1027, contenant l'expression Ds-ROUGE vecteur pGMDs3, et ca. 120 ufc de M. marinum souche Mma20. La suspension bactérienne injectée va suivre le flux sanguin dans la veine caudale vers le cœur. Surveiller si l'injection a été exécutée correctement par la vérification d'un volume en expansion du système vasculaire directement après l'impulsion de 2. Pour les expériences de dose-réponse, 2-3 injections consécutives peut être effectuée sans extraction de l'aiguille.
  8. Vérifiez fréquemment que le volume d'injection reste le même pendant l'expérience. Pour fournir un contrôle de la cohérence des injections dans l'expérience, injecter un drop des bactéries directement dans une goutte de PBS stérile sur milieu de croissance bactérienne après environ chaque injection d'embryons 30 e. Plaque à cette baisse et de compter les colonies bactériennes après incubation pour déterminer les unités formant colonies (UFC) dans le volume d'injection.
  9. Utilisez un stéréomicroscope à fluorescence (protocole 7) pour observer individuelle fluorescente S. cellules typhimurium circulant dans le sang directement après l'injection, et jeter les embryons qui ne sont pas correctement injectés. Individuel fluorescente M. bactéries marinum peut pas être observée par microscopie à fluorescence stéréo directement après les injections, mais les agrégats fluorescents de cellules infectées doit être visible par 2 jours après l'infection (dpi) et grossissent au fil du temps.

6. Autres voies d'infection

  1. Conduits d'injection Cuvier: line up embryons anesthésiés (2-3 dpf) sur une plaque plane d'agarose 1% injection que pour les injections veine caudale (voir 5.6). Orienter la injecterplaque d'ions à la main lors des injections de placer des embryons dans la position préférée pour l'insertion de l'aiguille, c'est à dire en diagonale sous un angle de 45 ° de sorte que le conduit de Cuvier peut être approché par la pointe de l'aiguille de la face dorsale de l'embryon (figure 1B) . Insérez l'aiguille dans le point de départ du canal de Cuvier tout dorsale à l'endroit où le conduit commence élargissement sur le sac jaune et injecter 100-200 bactéries (1-3 nL). L'injection est correcte si le volume intérieur du conduit se dilate directement après l'impulsion et le sac vitellin n'est pas rompu. Comme pour les injections veine caudale (voir 5.7), plusieurs injections consécutives peut être effectuée sans extraction de l'aiguille.
  2. D'injection ventricule rhombencéphale: aligner embryons anesthésiés (32 HPF) sur une plaque plane d'agarose 1% injection de telle sorte que les embryons sont positionnés avec leur côté dorsal vers le bout de l'aiguille. Insérez l'aiguille dans le ventricule du cerveau postérieur d'une position antérieure sans toucher à la neuroepithelium (figure 1C) et injecter 20-100 bactéries (0.5-1 nL). Pour pratiquer la procédure, utilisez un colorant fluorescent (comme le Texas-Red dextran), comme indiqué dans un autre article vidéo 13.
  3. D'injection musculaire Queue: embryons de position anesthésiés (1-2 dpf) que pour les injections veine caudale (voir 5.6). Ajuster la micromanipulateur avec l'aiguille chargée à un angle d'environ 65 ° par rapport à la surface de plaque d'injection. Injecter une suspension bactérienne (0.5-1 nL) contenant 20 à 50 ufc dans le muscle au-dessus de l'ouverture uro-génital (figure 1D) sans causer de dommages à la notocorde ou des vaisseaux sanguins.
  4. Injection vésicule otique: embryons de position anesthésiés (2-3 dpf) que pour les injections veine caudale (voir 5.6). Ajuster la micromanipulateur avec l'aiguille chargée à un angle d'environ 65 ° par rapport à la surface de plaque d'injection. Injecter environ 20 bactéries (0,5 nL) dans la vésicule otique (figure 1E) avec la presse à faibleure pour éviter une rupture du tissu local.
  5. Injection notochorde: line up embryons anesthésiés (1-2 dpf) sur une plaque plane d'agarose 1% injection de telle sorte que les embryons sont positionnés avec leur queue pointant vers l'extérieur de la pointe de l'aiguille. Insérez l'aiguille dans le tissu musculaire queue dans la notochorde (Figure 1F) et injecter environ 20-50 bactéries (maximale 0,5 nL). Prenez soin de ne pas injecter trop de volume pour éviter une rupture de la notocorde.
  6. Injection jaune d'oeuf: oeufs de position contenant des embryons au stade de 16 à 1000 cellules sur une plaque d'agarose 1% injection avec canaux rectangulaires ou en forme de V faites avec un moule de 12 canaux ou en ligne à http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . Percer l'aiguille à travers le chorion dans le centre du jaune (figure 1G) et injecter bactéries 20-40 (1-2 nL). L'utilisation de la solution de 2% pour les porte-PVP40 la suspension bactérienne (voir l'étape 3.5)est important de prévenir la propagation des bactéries au début dans l'embryon.

7. L'image stéréo de l'infection

  1. Anesthésier les embryons infectés dans un plat agarose à 1% en couches de Petri couverte avec de l'eau contenant l'œuf tricaïne (voir 4.5).
  2. Alignez les embryons dans la bonne position pour l'imagerie sous un microscope à fluorescence stéréo avec un outil en boucle les cheveux (Figure 2). Avant la vessie natatoire a gonflé (1-5 dpf), les embryons seront à plat sur les côtés permettant d'imagerie à vision latérale.
  3. Si une position différente de celle du point de vue latérale est nécessaire, monter les embryons dans la méthylcellulose 1,5%. Manipuler l'embryon dans la position souhaitée avec un outil en boucle les cheveux (Figure 2).
  4. Retour des embryons d'œufs à l'eau après l'imagerie.

8. Imagerie confocale de l'infection

  1. Déposer une goutte de bas point de fusion d'agarose (Lonza Inc, 1,5% (p / v) dans l'eau d'œuf) sur le fond de verre d'unWillCo-vaisselle (WillCo puits, GWSt-5040) si un microscope inversé confocal est utilisé, ou sur une lame dépression seule cavité (gélose scientifique, L4090) si un microscope confocal est utilisé en position verticale.
  2. Placez l'embryon anesthésié dans la goutte d'agarose avec une quantité limitée d'eau oeuf et de manipuler l'embryon en position avec un outil en boucle les cheveux (Figure 2). Lors de l'utilisation d'un microscope inversé, il est important que la région de l'embryon d'intérêt est à plat contre le fond de verre de l'antenne d'imagerie. Un microscope droit peut être utilisé en combinaison avec immersion dans l'eau ou des objectifs interurbains sèches et l'embryon doit être positionné de telle sorte que la région d'intérêt est le plus près de l'objectif que possible.
  3. Laissez l'agarose se solidifier et de submerger la chute d'agarose dans l'eau d'œuf contenant tricaïne (voir 4.5). Si un microscope droit est utilisé, placer une lamelle de verre sur le dessus de la cavité dépression (ne permettent pas de bulles d'air pour former).
  4. Séquentiellement acquérir la grippeorescence et des images de transmission.
  5. Retirez délicatement le agarose de l'embryon avec des pincettes fines et placez l'embryon de retour dans l'eau d'œuf si elle est nécessaire pour d'autres expériences.

9. Les résultats représentatifs

L'injection de Salmonella typhimurium ou Mycobacterium marinum bactéries dans l'île du sang d'embryons à 1 résultats dpf dans la phagocytose par les macrophages rapide. Le gène mpeg1 a récemment été identifié comme un marqueur fidèle de macrophages embryonnaires, colocalisent avec le CSF1R bien établie macrophages marqueur (FMS) et ne se chevauchent pas avec des marqueurs de neutrophiles tels que megapixels (MPO) et Lyz 4, 14. Pour l'imagerie en direct de la phagocytose bactérienne, nous avons utilisé des lignées transgéniques dans lesquelles le promoteur dirige l'expression mpeg1 protéine fluorescente dans des macrophages 14. Ces lignées transgéniques soit le promoteur f mpeg1utilisée directement pour le gène GFP ou employer un système à deux composants, où le promoteur dirige l'expression mpeg1 du facteur de transcription de levure GAL4 qui active un second transgène avec la séquence de reconnaissance de Gal4 (UAS, en amont activation des séquences) fusionnés au gène kaede. Lorsque l'injection de sang île (protocole n ° 5; Figure 1A) est effectuée correctement, les bactéries seront immédiatement circuler à travers la circulation sanguine et se propager dans l'embryon. Diffusion de la relativement grande et vive fluorescente Ds-ROUGE étiqueté S. bactéries typhimurium peut être directement représentées avec un microscope stéréo fluorescence (figure 3A), et l'imagerie confocale à des salons hpi 2 que de nombreuses bactéries sont phagocytées par des macrophages fluorescentes (figure 3B-C). L'injection d'aussi peu que 25 ufc de type sauvage S. bactéries typhimurium se traduira par une infection mortelle, alors qu'une dose similaire de bactéries d'un s avirulentetrain, comme Ra, peut être effacé par le système immunitaire 3 embryonnaire. Une dose d'injection de 250 ufc a été utilisé pour déterminer les réponses transcriptionnelles à S. l'infection typhimurium chez l'embryon de poisson zèbre et démontré l'induction d'une forte pro-inflammatoire de réponse l'expression des gènes 15. En revanche, l'injection intraveineuse de M. marinum bactéries ne provoque pas une forte réponse pro-inflammatoire, mais conduit à une infection persistante où les macrophages infectés former des agrégats serrés qui sont considérés comme les premières étapes de granulomes, qui sont la marque distinctive de la tuberculose 2. Imagerie confocale d'un tel agrégat granulome-comme dans la Tg (mpeg1: EGFP) gl22 la ligne 14 à 5 dpi montre la croissance intracellulaire de mCherry marqué M. bactéries marinum l'intérieur des macrophages verts fluorescents (Figure 3D-E).

Otses voies d'infection sont utiles à des fins différentes. Bactéries peut être injecté dans le ventricule rhombencéphale à 32 hpf (figure 1C), qui est un compartiment sans macrophages. Injection de 20-100 mCherry marqué M. bactéries marinum dans ce compartiment conduit à l'infiltration rapide par les macrophages phagocytent les bactéries que (figure 4A). Une autre méthode pour étudier la migration dirigée de cellules immunitaires innées est l'injection de bactéries dans le muscle queue (figure 1D). Cependant, les injections musculaires queue aussi causer des dommages aux tissus qui en elle-même suscite une certaine attraction des leucocytes. Une telle réaction traumatique peuvent être évités lorsque attentivement l'injection d'un petit volume (0.5-1 nL) dans la vésicule otique (figure 1E). Comme le montre ici en utilisant la Tg (mpx: EGFP) I114 ligne 16, l'injection d'environ 20 UFC de S. typhimurium dans la vésicule otique conduit à l'attraction des neutrophiles à 3 hpi ( (figure 4E). La notocorde, qui semble être résistant à l'infiltration par les leucocytes, est un compartiment permissive pour la croissance de M. mutants marinum qui sont fortement atténué lorsqu'il est injecté dans d'autres tissus (7; Figure 4F). Enfin, l'injection précoce de M. marinum dans le jaune d'embryons fournit une méthode alternative pour parvenir à une infection systémique. En général, nous effectuer ces injections autour de la scène 16 cellules (Figure 1G), mais des injections bactériennes dans le jaune d'oeuf peut également être effectuée à un stade ultérieur (jusqu'à l'étape de 1000 cellules), ou plus tôt (1 à 8 stade cellulaire) pour la co-injections avec morpholinos 8. Après injection de jaune d'une dose de 20-40 ufc, M. bactéries marinum étalé sur plusieurs jours dans les tissus embryonnaires et le formulaire de granulome-comme des agrégats semblables à ceux observés sur le classiqueméthode d'injection par voie intraveineuse 8; (4G Figure). Procédé d'injection jaune n'est pas adapté pour S. l'infection typhimurium, parce que sa croissance rapide dans le jaune provoque létalité précoce. La méthode d'infection jaune pour M. l'infection marinum sera utile pour applications à haut débit car il peut être automatisé en utilisant un robot d'injection 8.

Figure 1
Figure 1. Aperçu des méthodes d'injection utilisées pour établir des infections systémiques ou locales dans les embryons de poisson zèbre. (AB) injections intraveineuses pour établir une infection systémique rapide sont réalisées dans la veine caudale à l'île du sang postérieure au 1 dpf (A) ou dans le canal de Cuvier à 2-3 dpf (B). (CE) injections locales pour l'étude des macrophages et la chimiotaxie des neutrophiles sont effectuées dans le ventricule du cerveau postérieur au 1 dpf (C), Le muscle queue à 1-2 dpf (D) ou de la vésicule otique à 2-3 dpf (E). (F) Injections pour créer une infection apparemment inaccessible aux phagocytes sont effectuées dans la notochorde à 1-2 dpf. (G) Injections de créer une infection systémique précoce avec lenteur la croissance des bactéries telles que M. marinum peut être effectuée dans le jaune, au stade de 16 à 1000 cellules. Toutes les images ont été prises avec un Leica M165C, Planapo 1.0x relié à une caméra Leica DFC420 (Leica 10446307 0.8x).

Figure 2
Figure 2. Outil de boucle de cheveux. Un morceau de cheveu humain est inséré comme une boucle dans l'ouverture d'une pipette Pasteur et fixé en place avec la super glue ou avec Tipp-Ex. Cela fournit un outil pratique pour manipuler délicatement embryons de poisson zèbre fragiles.

Figure 3
Figure 3. Les injections intraveineuses derouge fluorescent Salmonella typhimurium et Mycobacterium marinum. Ds-ROUGE marqué S. typhimurium SL1027 bactéries (AC) et mCherry marqué M. marinum Mma20 bactéries (DE) ont été injectés dans l'île du sang de la Tg (mpeg1: Gal4-VP16) GL24; Tg (UAS-E1b: Kaede) s1999t (AC) ou Tg (mpeg1: EGFP) embryons de poisson zèbre gl22 (DE) à 28 HPF. (A) superposition d'image stéréo-fluorescence et à champ clair montrant la diffusion de S. typhimurium dans la circulation sanguine à 2 hpi (Leica MZ16FA microscope avec Leica DFC420C caméra). (Colombie-Britannique) confocale Z-stack projections montrant rouge S. bactéries typhimurium phagocytées par des macrophages verts à 2 hpi (Leica TCS SPE, HCX objectif 40x APO 0,8 NA). Les bactéries qui sont encore extracellulaire peut également être observée. (D) confocale z-stack de projection montrant un agrégat granulome-comme contenant M. macrophages marinum Mma20-infectés et non infectés à 5 dpi (Leica TCS SPE, HCX APO 40x0,8 NA). Les macrophages et les bactéries en vert en rouge. (E) confocale z-stack projection d'un macrophage individuelle (vert) avec M. intracellulaire bactéries marinum (rouge). La zone représentée en D par le rectangle blanc a été imagées avec un objectif plus fort grossissement (Leica TCS SPE, HCX PL APO 63x 1,2 NA). Scalebars: 20 pm.

Figure 4
Figure 4. Des itinéraires alternatifs pour l'infection d'embryons de poisson zèbre. (A) mCherry marqué M. marinum Mma20 bactéries ont été injectés dans le ventricule du cerveau postérieur au 32 HPF. Fluorescence et superposition d'image transmission montrant des bactéries mCherry-étiquetés phagocytées par des macrophages à 5 hpi (Leica TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0,7 NA). (B) S. typhimurium a été injecté dans le muscle queue à 1 dpf. Attraction des cellules myéloïdes au site d'injection (cercle blanc) est montré à 3 hpi par fluorescent hybridation in situ en 4, (C), tandis que dans les embryons non-injecté, il ya normalement pas de cellules myéloïdes à ce site morphologique. Bien que les embryons ne contiennent pas de neutrophiles matures à ce stade, deux populations de cellules myéloïdes peuvent être distingués, l'un exprimant le marqueur de macrophages mfap4 (rouge) et un exprimant le marqueur de neutrophiles megapixels (vert) (Leica TCS SPE, HC PL Fluotar 10.0x 0,3 NA). Fluorescence des bactéries est perdue après la procédure en hybridation in situ. (D) Ds-ROUGE marqué S. bactéries typhimurium ont été injectés dans la vésicule otique de Tg (mpx: EGFP) I114 poisson-zèbre à 2 dpf. Superposer des images stéréo-fluorescence et lumineux champ montrent que megapixels: EGFP cellules marquées neutrophiles sont attirés par la vésicule otique infectée (en pointillés ellipse) à 3 hpi, (E) alors que l'injection de contrôle de PBS dans la vésicule otique de Tg (mpx: EGFP ) I114 le poisson-zèbre ne montre pas l'attraction des neutrophiles à l'ai infecté otiquesicle (en pointillés ellipse) (Leica MZ16FA avec Leica DFC420C caméra). (F) mCherry marqué M. bactéries marinum de la eccCb1 atténué E11 :: tn souche mutante 17 ont été injectés dans la notochorde à 1 dpf. Prolifération à l'intérieur de la notocorde a été imagée à 5 dpi (Leica MZ16FA microscope avec DC500 appareil photo). (G) mCherry marqué M. marinum bactéries E11 ont été injectés dans le jaune de 16 cellules embryons de poisson zèbre en scène de la Tg (fli1a: EGFP) ligne qui exprime la GFP dans les cellules endothéliales de vaisseaux sanguins et lymphatiques. Formation d'un granulome-comme des agrégats de cellules infectées dans la région caudale est observée à 5 dpi (microscope Leica MZ16FA avec Leica DFC420C caméra; l'image de 8).

Discussion

Les méthodes d'infection décrites dans cet article sont fréquemment utilisés pour étudier la fonction de gènes de l'hôte de l'immunité innée ou des gènes de virulence bactériens 1. Les micro-injection par voie intraveineuse (méthodes des protocoles 5 et 6.1) sont utilisés le plus souvent pour de telles études. La veine caudale à l'île du sang postérieure est l'endroit le plus commode pour l'injection intraveineuse de 1-jour vieux embryons. Comme la veine caudale devient plus difficile de pénétrer à des stades ultérieurs, nous préférons le canal de Cuvier en tant que site d'injection par voie intraveineuse pour les embryons à 2-3 dpf. Dans tous les cas, il est essentiel d'injecter des embryons avec des chiffres cohérents de bactéries, ce qui doit être vérifiée par l'injection de placage inoculums pour le comptage des CFU. Les aspects suivants doivent être considérés pour atteindre injections reproductibles. Tout d'abord, il est essentiel de disposer d'aiguilles de haute qualité en verre injection microcapillaires. Si la pointe de l'aiguille est trop grande, l'injection va créer un trou de perforation assez grand pour des saignements de se produire etles bactéries injectées s'écoule de la circulation sanguine. Deuxièmement, les bactéries doivent être injectés directement dans la circulation sanguine. Si la pointe de l'aiguille n'est pas à l'intérieur de la veine ou si les écarts de fluides d'injection dans l'extension du sac vitellin, l'embryon doit être mis au rebut de l'expérience. Troisièmement, à l'aide PVP40 comme support pour injecter M. marinum aidera à prévenir les bactéries de sombrer dans l'aiguille de verre. PVP40 améliore l'homogénéité de la suspension, ce qui entraîne inoculums plus reproductibles pendant toute la durée d'injections. PVP40 peut également être utilisé pour S. injections typhimurium, mais ici il est moins important parce que la plus grande taille et de la fluorescence lumineuse des bactéries permet un contrôle visuel sur l'inoculum d'injection au cours des expériences. Pour pratiquer les injections, nous recommandons l'utilisation de phénol colorant rouge (1% v / v) ou 1 pm sphères fluorescentes disponibles en différentes couleurs (Invitrogen). Une fois que la technique est maîtrisée, il faut environ 30 minutes pour injecter 50-100 embryons, y compris le temps nécessaire pour aligner les embryons sur des plaques d'agarose et le réglage du volume d'injection bactérienne.

Alors que les injections intraveineuses dans l'île du sang (protocole 5) ou dans le canal de Cuvier (protocole 6.1) sont les plus couramment utilisés, les autres voies d'infection décrites dans cet article la vidéo se sont révélées utiles pour étudier des macrophages et des neutrophiles chimiotactisme (protocoles 6.2, 6.3 , et 6.4), pour étudier la croissance des souches bactériennes atténuées (protocole 6.5), et d'adapter le modèle d'infection le poisson-zèbre pour applications à haut débit (protocole 6.6) 4-8. Les décrits de micro-injection méthodes peuvent également être appliquées pour des injections de virus 18, 19, les spores fongiques 14, 20 ou parasites protozoaires (Maria Forlenza, communication personnelle). Un complément utile aux procédures d'injection décrites dans cet article la vidéo est une procédure récemment décrit pour injection sous-cutanée de bactéries dans zebrembryons afish 21. Cette procédure a été appliquée à l'étude la phagocytose des bactéries par les neutrophiles, qui ont été trouvés pour les bactéries de manière efficace sur les surfaces des tissus engloutissent, mais, contrairement à macrophages, étaient pratiquement incapables de phagocyter les bactéries lors de l'injection dans le sang ou dans les cavités corporelles remplies de liquide. Pour les embryons injections sous-cutanées sont positionnés les mêmes que pour les injections musculaires queue décrites dans cet article la vidéo, mais l'aiguille est insérée sous la peau pour injecter des bactéries sur une somite.

Il est important de considérer que la micro-injection est essentiellement une voie artificielle de l'infection. Cependant, les embryons précoces sont très résistants à l'exposition externe aux pathogènes bactériens. En fait, les essais d'immersion, où les embryons sont baignés dans une suspension bactérienne, ne sont pas reproductibles dans nos mains 22. Alors que certains embryons peuvent être infectés lors de l'immersion, nous avons observé une grande variation dans les taux de mortalité et de l'expressions de gènes marqueurs inflammatoires entre les embryons individuels dans de tels essais. Les méthodes d'injection de micro-décrites dans cet article d'atteindre les infections reproductibles et sont particulièrement utiles pour étudier les interactions bactéries avec les cellules immunitaires innées d'accueil. Une approche efficace pour quantifier une infection bactérienne chez les embryons individuels est d'analyser les images fluorescentes d'embryons infectés par le sur-mesure, le logiciel dédié pixel quantification 17, 23. Cette approche a été démontré une bonne corrélation avec les résultats de UFC après placage d'embryons infectés. De même, les changements relatifs dans le nombre de leucocytes par embryon ont été quantifiés par analyse d'image numérique dans les lignes de leucocytes transgéniques journaliste fluorophores; cette approche serait applicable à la quantification de la réponse de l'hôte à l'infection leukopoietic 24.

La fonction de gènes immunitaires innées de l'hôte peuvent être étudiés efficacement in vivo par la combinaison des modèles d'infection décritesavec effet de choc morpholino. Morpholinos sont des oligonucléotides antisens synthétiques qui ciblent ARN spécifiques et de réduire l'expression des produits géniques lorsqu'il est injecté dans 1-cellules embryons de poisson zèbre scène comme le montre la vidéo d'autres articles dans cette revue 10, 25. Dans les études knockdown morpholino, il est d'une grande importance que tous les groupes d'embryons doivent être comparées sont mis en scène correctement avant les injections bactériennes. Ceci est particulièrement important parce que les embryons ont un système immunitaire en développement qui devient de plus en plus compétente au fil du temps.

Il ya plusieurs lignes de reporter transgéniques actuellement disponibles pour distinguer les grands sous-ensembles innées immunitaire, les macrophages et les polynucléaires neutrophiles, en embryons de poisson zèbre. Le megapixels et promoteurs Lyz ont été utilisés pour générer des lignes de reporter neutrophiles 16, 26, 27, et le CSF1R (FMS) et MPEG1 promoteurs ont été utilisés pour produire des journalistes macrophages 14, 28. Alors que csf1r (FMS) est en outre exprimé dans xanthophores, mpeg1 expression est exclusivement dans les macrophages. Comme le montre dans cet article la vidéo, les mpeg1 récemment mis au point des lignes journaliste sont très utiles pour la phagocytose par les macrophages imagerie bactérienne.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Cui Chao, étage de Kort, Stoop Esther et Ralph Carvalho pour les images de la figure 4, Ulrike Nehrdich et Davy de Witt pour les soins de poissons, et les membres de laboratoire pour d'autres discussions utiles. Ce travail est soutenu par le Programme Smart Mix du ministère néerlandais des affaires économiques et le ministère de l'Education, la Culture et de la Science, de la 7ème Commission européenne cadre du projet ZF-Santé (Santé-F4-2010-242048), l'Union européenne Marie-Curie Formation initiale réseau FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), et par le NHMRC australien (637 394). L'Australien de médecine régénérative Institut est soutenu par des subventions du gouvernement de l'État de Victoria et le gouvernement australien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Glycerol Sigma-Aldrich 228210
Difco Middlebrook 7H10 agar BD Biosciences 262710
BBL Middlebrook OADC Enrichment BD Biosciences 211886
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment BD Biosciences 211887
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Calbiochem 529504
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387
SeaPlaque Agarose (low melting point agarose) Lonza Inc. 50100
FluoSpheres (1.0 μm, red fluorescent (580/605)) Invitrogen F8821
FluoSpheres (1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515)) Invitrogen F8823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  3. vander Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  4. Zakrzewska, A. Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity. Blood. 116, 1-11 (2010).
  5. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126, 3735-3745 (1999).
  7. Alibaud, L. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).
  8. Carvalho, R. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).
  9. van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components. Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).
  10. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).
  11. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).
  13. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).
  14. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 49-56 (2011).
  15. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection. J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).
  16. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  17. Stoop, E. J. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).
  18. Levraud, J. P. Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system. Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).
  19. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).
  20. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  21. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).
  22. van Soest, J. J. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).
  23. Adams, K. N. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145, 39-53 (2011).
  24. Ellett, F. L., Lieschke, G. J. Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos. Methods in Enzymology. , (2011).
  25. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).
  26. Mathias, J. R. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).
  27. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).
  28. Gray, C. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).

Tags

Immunologie Numéro 61 embryon du poisson zèbre l'immunité innée les macrophages l'infection Salmonella Mycobacterium la micro-injection l'imagerie de fluorescence,
L'infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benard, E. L., van der Sar, A. M.,… More

Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (61), e3781, doi:10.3791/3781 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter