Summary
Isolar microglia primária a partir da heterogeneidade celular do cérebro é essencial para investigar o seu papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo descreve um isolamento mecânico e técnica de cultura mista de células que fornece alto rendimento e elevada pureza, viáveis primárias células microgliais para
Abstract
Microglia conta para aproximadamente 12% do total da população celular no cérebro de mamíferos. Embora os neurónios e astrócitos são considerados os tipos de células principais do sistema nervoso, microglia desempenhar um papel significativo na fisiologia normal do cérebro através da monitorização do tecido para que os detritos e os agentes patogénicos e manutenção da homeostase do parênquima através 1,2 actividade fagocítica. A microglia é ativada durante uma série de lesões e doença, incluindo doenças neurodegenerativas, lesões cerebrais traumáticas e infecção do sistema nervoso 3. Sob estas condições de ativação, microglia aumentar sua atividade fagocitária, passam por mudanças morpohological e proliferativa, e ativamente secretam espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, pró-inflamatórias quimiocinas e citocinas, muitas vezes, ativando um loop parácrina ou autócrina 4-6. Como essas respostas microgliais contribuir para a patogênese da doença em condições neurológicas, a pesquisa focada em microglia se justifica.
Devido à heterogeneidade celular do cérebro, é tecnicamente difícil a obtenção de material de amostra suficiente microglial com pureza elevada durante experiências in vivo. A pesquisa atual sobre as funções neuroprotetoras e neurotóxico de microglia exigir um método de rotina técnica para gerar consistentemente microglia puro e saudável, com rendimento suficiente para o estudo. Apresentamos, no texto e vídeo, um protocolo para isolar microglia primário puro a partir de culturas da glia mistos para uma variedade de aplicações a jusante. Resumidamente, esta técnica utiliza tecido cerebral dissociada crias de rato neonatal para produzir mistos culturas de células gliais. Após as culturas mistas gliais atingir a confluência, microglia primárias são mecanicamente isolado a partir da cultura por um breve duração de agitação. Os microglia são então plaqueadas a elevada pureza para o estudo experimental.
O princípio e protocolo desta metodologia ter sidodescrito na literatura 7,8. Além disso, as metodologias alternativos para isolar microglia primários estão bem descritos 9-12. Tecido cerebral homogeneizado podem ser separados por centrifugação em gradiente de densidade para produzir microglia primário 12. No entanto, a centrifugação é de comprimento moderado (45 min) e pode causar danos celulares e activação, assim como, causar enriquecido microglia e outras populações celulares. Outro protocolo tem sido utilizada para isolar a microglia primária em uma variedade de organismos por prolongada (16 horas), agitando ao mesmo tempo em cultura 9-11. Após agitação, o sobrenadante é centrifugado meios para isolar a microglia. Este método de isolamento de mais duas etapas também podem perturbar a função e ativação da microglia. Nós principalmente utilizar o protocolo de isolamento seguinte microglia no nosso laboratório para um número de razões: (1) primária microglia simular em biologia in vivo mais fielmente que imortalizadas linhas celulares de roedores microglia, (2) Uma ruptura nominal mecânica minimiza disfunção celular potencial ou activação, e (3) o rendimento suficiente pode ser obtida sem passagem das culturas mistas de células gliais.
É importante notar que este protocolo utiliza o tecido cerebral de crias de rato neonatal para isolar microglia e que a utilização de ratos mais velhos para isolar microglia pode ter um impacto significativo no rendimento, estado de activação, e as propriedades funcionais da microglia isolado. Há evidências de que o envelhecimento está relacionada com a disfunção microglia, neuroinflamação aumentada e patologias neurodegenerativas, assim estudos anteriores têm utilizado ex vivo adulto microglia para compreender melhor o papel da microglia em doenças neurodegenerativas, onde o envelhecimento é parâmetro importante. No entanto, ex vivo microglia não pode ser mantido em cultura durante períodos prolongados de tempo. Consequentemente, embora este protocolo prolonga a vida da microglia primária em cultura, deve notar-se que a microglia comportar differently de adulto microglia e estudos in vitro deve ser cuidadosamente considerado quando traduzido para uma definição em vivo.
Protocol
1. Dissecção da Tissue Neonatal cérebro de rato
- L-15 de Leibovitz frio meios condicionados (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) a 4 ° C. Meios de cultura quentes (DMEM + 10% FBS + 1% de penicilina / estreptomicina) para 37 ° C. Prepare 4 60x15 mm pratos de Petri com 4-5 ml de L-condicionado de 15 meios de comunicação sobre o gelo. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com 100% de etanol.
- Lavar as P2 filhotes rap neonatais com etanol 70%. (Crias de ratos neonatais com idades compreendidas entre P1-P5 pode ser usado neste protocolo.)
- Rapidamente decapitar um rato filhote com uma tesoura afiada estéreis e soltar a cabeça imediatamente em etanol 70%. Repetir para um total de 5 crias de rato, em seguida, transferir cabeças em solução salina.
- Remover os cérebros inteiros das cabeças e coloque em uma placa de Petri com 4 - 5 ml de solução de L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + 1% Pen / Strep) em gelo.
- Repita os procedimentos 1.2 - 1.4 para os filhotes restantes no lixo.
- Remover as meninges a partir do cérebro e transferir o destecido cerebral IRED (isto é, córtex, cerebelo, cérebro inteiro, etc) em uma placa de Petri de novo com 4-5 ml de solução de L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) em gelo.
2. Preparação de população mista de células da glia
- Sem o tecido cerebral prejudicial com uma tesoura ou uma lâmina, transferir o tecido com uma pipeta de 10 ml para um tubo estéril de 50 ml cónico.
- Centrifugar a 2.500 cónica RCF durante 5 min a 4 ° C.
- Aspirar o sobrenadante. Adicionar ml de 4-5 frescos meio L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep).
- Pipetar tecido cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de 10 ml estéril.
- Coloque um filtro celular (100 poros mm) para um novo tubo de 50 ml. Pipetar tecido cima e para baixo uma vez com uma solução estéril 5 ml pipeta e com a pipeta de descarga para o filtro de células, dispensar o material através do filtro de célula para dentro do tubo cónico.
- Lavar o filtro de células com 4-5 ml de frescos meio L-15 (Leibowitz L-15 + BS 0,1%Um Pen + 1% / Strep).
- Centrifugar cónica com células tensas a 2.500 RCF durante 5 min a 4 ° C.
3. Chapeamento e manutenção da cultura mista de células gliais
- Para cada cérebro de rato pup processado, preparar 1 T-75 estéreis do balão por adição de 12 ml de meio de cultura (DMEM + 10% FBS + 1% de penicilina / estreptomicina) em cada frasco.
- Aspirar o sobrenadante das células peletizadas e adicionar 5-6 ml de meio de cultura para o sedimento de células. Pipetar cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de 10 ml.
- Transferir um volume igual de suspensão de células a cada balão T-75.
- Incubar em frascos de 5% de CO 2 incubadora a 37 ° C durante um total de 1-3 semanas.
- Frascos deve ser primeiro incubadas durante 5 dias, e no quinto dia, substituir os meios de cultura em cada balão com 12 ml de meio fresco e retornar para a incubadora. Em seguida, a cada 3 dias, substituir os meios condicionados em cada balão com 12 ml de meio fresco para atingir confluência. Isso deve ser fazerne com muito cuidado, sem tocar no fundo dos frascos, onde as células se ligam.
4. Isolamento e Chapeamento de Microglia primária
- Após cultura mista de gliais são completamente confluentes, remover frascos da incubadora e cobrir as tampas recipiente com parafilme para evitar a troca gasosa com o ar ambiente.
- Agitar frascos de 100 RPS (Lab Companion SI-600, Jeio Tech) durante 1 hora a 37 ° C.
- Collect meios de comunicação de todos os frascos com uma pipeta de 10 ml sem perturbar a camada de astrócitos na superfície balão. Coloque a mídia em tubos de 50 ml. Adicionar meios frescos aos frascos e frascos de retorno para a incubadora.
- Centrifugar a 2.500 tubos cónicos RCF durante 5 min a 4 ° C.
- Aspirar o sobrenadante a partir de todos os tubos cónicos. Peletes de células são células da microglia de alta pureza. Ressuspender pelotas em 1 ml de plaqueamento microglia media (DMEM + FES 10% + 1% de penicilina / estreptomicina).
- Contar a densidade celular nos meios de comunicação que utilizam ressuspensosum hemocitómetro.
- Adicionar um volume apropriado de meios de revestimento microglia para atingir um 2 x 10e5 células por ml de densidade. Placa conforme for apropriado para análise experimental.
- Permitir microglia para anexar durante a noite.
5. Os resultados representativos
O protocolo descrito acima resulta em alta pureza culturas primárias microglia. Como determinado por imuno-histoquímica para um marcador de células de macrófagos / microglia específico (Iba1), as culturas são chapeadas microglia> puro a 90% (Figura 2). Além disso, a coloração para os marcadores de células de astrócitos, oligodendrócitos e neurónio específicos demonstra a contaminação mínima (Figura 2). Depois de estabelecer cultura mista de células gliais, microglia pode ser isolado por agitação até 4 vezes sucessivas. O isolamento inicial microglia irá produzir aproximadamente 2,2 x 106 células / ml ou cerca de 9 milhões de células por 10 frascos eo rendimento esperado diminui com cada sha sucessivake. Microglia isolado por este método têm sido utilizados com sucesso para investigar a capacidade de fagocitose, função, tais como a produção de óxido nítrico, e toxicidade neuronal (Figura 3) 13-14.
Figura 1. Visão geral do protocolo para a preparação de mistura de culturas de células gliais e de isolamento da microglia primária.
Figura 2. Isolamento de microglia alta pureza como verificado pela análise imuno-histoquímica usando microglia (Iba-1, vermelho), astrócitos (GFAP, verde), neurônio (NeuN, vermelho) e oligodendrócitos (CC1, vermelho) marcadores específicos. A coloração para DNA de células em cultura por DAPI (azul) é também mostrada.
Figura 3. Microglia isolado no método descricama têm sido usados em vários ensaios, incluindo, mas não se limitam a, ensaios de fagocitose, ensaios funcionais e estudos de neurotoxicidade. Nestes estudos, verificou-se que a microglia (Iba-1 positivo, verde), quando expostos a controlar (A) ou LPS (B) meios de comunicação tratados, aumentar a sua fagocitose de pérolas de látex marcadas por fluorescência (vermelho), que pode ser quantificado ( C). Além disso, LPS de tratamento (1ng/ml) pode aumentar a produção de óxido nítrico em microglia (D). Finalmente, através de ambos transwell inserto-separadas ou directos microglia-neuronais culturas, nós descobrimos que a microglia incubadas com LPS pode induzir a morte de células neuronais, como medido por lactato desidrogenase (LDH) de libertação (E, F).
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Discussion
Embora este protocolo é rotineiramente utilizado para produzir microglia puro e saudável para experimentos de pesquisa, uma análise cuidadosa dos aspectos técnicos, durante partes críticas do procedimento minimizar a variabilidade na microglia isolado. Primeiro, durante a dissecção do tecido do cérebro de filhotes de ratos neonatos, trabalhando em tempo hábil é necessário para minimizar os danos e hipóxico isquêmica do tecido. No entanto, é também importante para remover completamente o revestimento meníngeo a partir do cérebro durante a dissecção, porque a presença de meninges vai contribuir para a contaminação de fibroblastos significativa, devido à sua taxa de proliferação rápida sob estas condições de cultura.
Manuseamento, segundo suave do material de tecido durante a preparação da cultura celular mista glial também é importante para limitar os danos celulares, a morte, ou a activação da microglia excessiva. Ao adicionar meios de cultura, deve ser tomado cuidado para não danificar a seg astrócitosolayer. Além disso, agitando os frascos para o isolamento da microglia, ajustar a frequência de agitação pode ser necessário para evitar a chapinha ou a formação de bolhas de ar nos meios de comunicação. Estes eventos podem aumentar a contaminação astrócito ou causar danos às culturas de células. Ao desenvolver esta técnica no laboratório, pode ser necessário para iniciar com agitação baixa resistência física (por exemplo, 100 rpm) e observar a cultura de células e sobrenadante por microscopia, antes de aumentar força agitação ea duração para se obter um rendimento desejado da microglia sem contaminação de astrócitos.
Outra consideração durante a otimização deste protocolo no laboratório é a determinação da duração de tempo mistas culturas de células gliais deve ser mantida antes de isolar microglia primário para revestimento. Enquanto o isolamento inicial pode ocorrer a partir de 1 a 3 semanas pós-cultura de estabelecimento, a confluência da microglia na monocamada astrócito será diferente e pode, embiologia fluência microglial em experimentos a jusante. Além disso, isolamentos subsequentes a partir da cultura celular mista glial mesmo pode precisar de ser baseado na confluência da cultura, em comparação com uma duração especificada entre os procedimentos agitação. Além disso, uma vez que o rendimento da diminuição subsequente isolamento, é importante notar as propriedades celulares do microglia primária pode ser diferente do primeiro para o isolamento última. Assim, as experiências deve ser conduzida na técnica repetições com a notação de cuidado quando microglia são isolados.
Finalmente, embora este protocolo discute isolamento microglial a partir de ratos cérebros pup, o isolamento bem sucedido da microglia também pode ser conseguido usando ratinhos e outros tecidos nervosos, tais como as medulas espinais. Nenhuma alteração significativa para o protocolo é necessário para estes fontes alternativas microglia, para além de aumentar a ração plaqueamento inicial para as culturas mistas (isto é, 2 rato brains/T75 balão ou co espinal 3-4rds de P2 balão rato pups/T75). Além disso, como seria de esperar, o rendimento de células tende a diminuir, em conformidade com o material de partida reduzido. No entanto, apesar de obter rendimentos mais baixos do uso de tecido cerebral do rato, uma grande vantagem é ser capaz de investigar os mecanismos moleculares de microglia fisiologia e reatividade utilizando o tecido cerebral de camundongos transgênicos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Financiado pelo programa intramural na Universidade Militar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
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