Isolar microglia primária a partir da heterogeneidade celular do cérebro é essencial para investigar o seu papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo descreve um isolamento mecânico e técnica de cultura mista de células que fornece alto rendimento e elevada pureza, viáveis primárias células microgliais para In vitro Estudo e aplicações a jusante.
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Artigo de método
Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microglia conta para aproximadamente 12% do total da população celular no cérebro de mamíferos. Embora os neurónios e astrócitos são considerados os tipos de células principais do sistema nervoso, microglia desempenhar um papel significativo na fisiologia normal do cérebro através da monitorização do tecido para que os detritos e os agentes patogénicos e manutenção da homeostase do parênquima através 1,2 actividade fagocítica. A microglia é ativada durante uma série de lesões e doença, incluindo doenças neurodegenerativas, lesões cerebrais traumáticas e infecção do sistema nervoso 3. Sob estas condições de ativação, microglia aumentar sua atividade fagocitária, passam por mudanças morpohological e proliferativa, e ativamente secretam espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, pró-inflamatórias quimiocinas e citocinas, muitas vezes, ativando um loop parácrina ou autócrina 4-6. Como essas respostas microgliais contribuir para a patogênese da doença em condições neurológicas, a pesquisa focada em microglia se justifica.
Devido à heterogeneidade celular do cérebro, é tecnicamente difícil a obtenção de material de amostra suficiente microglial com pureza elevada durante experiências in vivo. A pesquisa atual sobre as funções neuroprotetoras e neurotóxico de microglia exigir um método de rotina técnica para gerar consistentemente microglia puro e saudável, com rendimento suficiente para o estudo. Apresentamos, no texto e vídeo, um protocolo para isolar microglia primário puro a partir de culturas da glia mistos para uma variedade de aplicações a jusante. Resumidamente, esta técnica utiliza tecido cerebral dissociada crias de rato neonatal para produzir mistos culturas de células gliais. Após as culturas mistas gliais atingir a confluência, microglia primárias são mecanicamente isolado a partir da cultura por um breve duração de agitação. Os microglia são então plaqueadas a elevada pureza para o estudo experimental.
O princípio e protocolo desta metodologia ter sidodescrito na literatura 7,8. Além disso, as metodologias alternativos para isolar microglia primários estão bem descritos 9-12. Tecido cerebral homogeneizado podem ser separados por centrifugação em gradiente de densidade para produzir microglia primário 12. No entanto, a centrifugação é de comprimento moderado (45 min) e pode causar danos celulares e activação, assim como, causar enriquecido microglia e outras populações celulares. Outro protocolo tem sido utilizada para isolar a microglia primária em uma variedade de organismos por prolongada (16 horas), agitando ao mesmo tempo em cultura 9-11. Após agitação, o sobrenadante é centrifugado meios para isolar a microglia. Este método de isolamento de mais duas etapas também podem perturbar a função e ativação da microglia. Nós principalmente utilizar o protocolo de isolamento seguinte microglia no nosso laboratório para um número de razões: (1) primária microglia simular em biologia in vivo mais fielmente que imortalizadas linhas celulares de roedores microglia, (2) Uma ruptura nominal mecânica minimiza disfunção celular potencial ou activação, e (3) o rendimento suficiente pode ser obtida sem passagem das culturas mistas de células gliais.
É importante notar que este protocolo utiliza o tecido cerebral de crias de rato neonatal para isolar microglia e que a utilização de ratos mais velhos para isolar microglia pode ter um impacto significativo no rendimento, estado de activação, e as propriedades funcionais da microglia isolado. Há evidências de que o envelhecimento está relacionada com a disfunção microglia, neuroinflamação aumentada e patologias neurodegenerativas, assim estudos anteriores têm utilizado ex vivo adulto microglia para compreender melhor o papel da microglia em doenças neurodegenerativas, onde o envelhecimento é parâmetro importante. No entanto, ex vivo microglia não pode ser mantido em cultura durante períodos prolongados de tempo. Consequentemente, embora este protocolo prolonga a vida da microglia primária em cultura, deve notar-se que a microglia comportar differently de adulto microglia e estudos in vitro deve ser cuidadosamente considerado quando traduzido para uma definição em vivo.
Protocolo
1. Dissecção da Tissue Neonatal cérebro de rato
- L-15 de Leibovitz frio meios condicionados (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) a 4 ° C. Meios de cultura quentes (DMEM + 10% FBS + 1% de penicilina / estreptomicina) para 37 ° C. Prepare 4 60x15 mm pratos de Petri com 4-5 ml de L-condicionado de 15 meios de comunicação sobre o gelo. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com 100% de etanol.
- Lavar as P2 filhotes rap neonatais com etanol 70%. (Crias de ratos neonatais com idades compreendidas entre P1-P5 pode ser usado neste protocolo.)
- Rapidamente decapitar um rato filhote com uma tesoura afiada estéreis e soltar a cabeça ....
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Discussão
Embora este protocolo é rotineiramente utilizado para produzir microglia puro e saudável para experimentos de pesquisa, uma análise cuidadosa dos aspectos técnicos, durante partes críticas do procedimento minimizar a variabilidade na microglia isolado. Primeiro, durante a dissecção do tecido do cérebro de filhotes de ratos neonatos, trabalhando em tempo hábil é necessário para minimizar os danos e hipóxico isquêmica do tecido. No entanto, é também importante para remover completamente o revestimento meníngeo a partir do.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Financiado pelo programa intramural na Universidade Militar.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de Catálogo | Comentários |
| 60 mm x 15 mm, placas de Petri | Fisher marca | 0875713A | |
| Afiadas tesouras de dissecação | Belas Ferramentas Ciência | 14094-11 | |
| Dumont # 7b fórceps padrão pontas, curvas, 11cm | Belas Ferramentas Ciência | 11270-20 | |
| Dumont # 5 fórceps padrão dicas, em linha reta, 11 cm | Belas Ferramentas Ciência | 11251-10 | |
| Cónico de 50 ml de tubos de centrifugação | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml pipetas sorológicas | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml pipetas sorológicas | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 filtro célula mM estéril nylon | Falcão | 35-2360 | |
| 75 cm 2 de cultura de tecidos frascos | Corning | 430641 | |
| Meio mínimo essencial de Dulbecco (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| L-15 de Leibovitz médio | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Soro fetal de bovino | Gibco (Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal soro eqüino | Pescador | SH3007402 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| Etanol a 100% | A Warner Empresa Graham | 64-17-5 | |
| Solução salina tamponada com fosfato, 10X, pH 7,4 | Qualidade Biológica, inc. | 119-069-131 | 1X em água destilada estéril |
| Sacos de Biohazard | VWR | 14220-028 | |
| Hemocitómetro | Hausser Científico | 1492 | |
| 6-poços de células placas de cultura com a superfície Cellbind | Corning | 3335 |
Referências
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W.
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Reimpressões e permissões
