מערכת ECIS / מוניות היא אוטומטית, בזמן אמת assay המודד chemotaxis סלולריים. ב assay זה, התאים לעבור מתחת לשכבה של agarose להגיע האלקטרודה היעד. התנועה נייד נמדדת הופעת עמידות 0 AC הנוכחי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
התנועה נייד בתגובה לגירויים חיצוניים חיונית תהליכים תאיים רבים, כולל ריפוי פצעים, דלקות כתגובה לזיהום. השיטה הנפוצה היא למדוד chemotaxis assay קאמרית בוידן, שבו תאים chemoattractant מופרדים על ידי קרום נקבובי. כמו תאים נודדים דרך הממברנה אל chemoattractant, הם דבקים התחתון של הקרום, או נפילה לתוך התקשורת הבסיסיים, והם מוכתמים מכן וספר חזותית 1. בשיטה זו, התאים נחשפים שיפוע תלול chemoattractant חולף, אשר נחשב ייצוג ירודה של הדרגתיים נמצאו ברקמות 2.
עוד מערכת assay, תחת agarose chemotaxis assay, 3, 4 צעדים תנועת התא על פני מצע מוצק בסרט מימית דק שיוצר מתחת לשכבת agarose. שיפוע שמתפתח agarose שטחית נחשב Appropriate ייצוג טבעי הדרגתיים. Chemotaxis ניתן להעריך על ידי הדמיה מיקרוסקופית של המרחק. שניהם assay קאמרית בוידן ו-assay תחת agarose מוגדרים בדרך כלל מבחני נקודות קצה.
מערכת אוטומטית ECIS / מוניות משלבת את הגישה מתחת agarose עם החשמל Cell-המצע התנגדות חישה (ECIS) 5, 6. ב assay זה, אלקטרודות היעד נמצאים כל אחד 8 חדרים. גדול נגד האלקטרודה עובר כל אחד 8 חדרים (איור 2). כל חדר מלא agarose ושתי בארות קטנים הם קיצוץ agarose משני צדי האלקטרודה היעד. אחד גם הוא מלא עם האוכלוסייה התא הבדיקה, ואילו השני מחזיק את מקורות chemoattractant לשדר (איור 3). הנוכחי עבר דרך המערכת יכולה לשמש כדי לקבוע את השינוי בהתנגדות המתרחשת כאשר תאים עוברים על האלקטרודה היעד. תאים על היעד electrodדואר להגביר את ההתנגדות של המערכת 6. כמו כן, תנודות מהירים ההתנגדות מייצגים שינוי יחסי הגומלין של התאים עם משטח האלקטרודה מעידים על שינויים מתמשכים צורה סלולריים. מערכת ECIS / מוניות יכולים למדוד את התנועה של האוכלוסייה התא בזמן אמת על פני פרקי זמן ארוכים, אבל גם רגיש מספיק כדי לזהות את בואם של תא בודד על האלקטרודה היעד.
Dictyostelium discoidium ידוע להעביר בנוכחות חומצה פולית שיפוע 7, 8 ו chemotactic התגובה שלו ניתן למדוד באופן מדויק על ידי ECIS / 9 מוניות. Chemotaxis ליקוציט, בתגובה SDF1α וגם היריבים chemotaxis יש גם למדוד עם ECIS / 10 מוניות, 11. למשל התגובה ליקוציט כדי SDF1α מוצג באיור 1.
פרוטוקול
1. ECIS / מוניות אלקטרודה הכנה
- משטח זהב של מערך ECIS / מוניות האלקטרודה (בהיקף של 8 תאים לכל שקופית) הוא התייצב לראשונה על ידי טיפול מקדים עם ציסטאין 10 mM סטרילית במים deionized (DH 2 O) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתנאים סטריליים.
- Aspirate הפתרון ציסטאין מן החדר כל אלקטרודה, יש לשטוף 3 פעמים עם סטרילית DH 2 O, ולהחליף μl 250 בינוני שלם (RPMI 1640, 10% FBS, 25 HEPES חיץ mM).
- חבר את מערך אלקטרודות כדי ליצור קשר עם מספר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מאפיינים חדשים של assay ECIS / מוניות כוללים את יכולתה להפוך אוסף של נתונים בזמן אמת כמו תאים להגיב chemoattractant. תוך יישום נפוץ ביותר של טכנולוגיה זו היא למדוד תגובות הסלולר הדרגתיים chemotactic בודדים, או הדרגתיים המורכבות תערובות של אגוניסטים chemotaxis ואת היריבים, הגישה ECIS / מוניות גם ניתנות וריאציות על אלו תצורות יכול להיות מועיל למדי הערכת התגובה התאית. אין עדות טובה כי חופפים או הדרגתיים עוקבים יכול להשפיע על התנהגויות הסלולר בדרכים חדשות. יתר על כן, סביר להניח כי אלה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
דוד Knecht ומיכאל ליינס יש פטנט על הטכנולוגיה שהונפקו ECIS / מוניות, אשר כפי כבר רישיון אוניברסיטת קונטיקט כדי יישומי לביופיסיקה, Inc
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (ES07408 ו EB00208).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| ECIS Zθ | לביופיסיקה שימושית | http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS אלקטרודה מערך | לביופיסיקה שימושית | 8W Chemotaxis | http://www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker יישומים מולקולרית | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone בסרום שור עוברית | Thermo Scientific | SH300703 | |
| פnicillin / סטרפטומיצין | מגה פיקסל Biomedicals | 1670049 | פניצילין 5,000 IU / mL: סטרפטומיצין 5 מ"ג / מ"ל |
| מאגר HEPES | מגה פיקסל Biomedicals | 1688449 | פתרון 1M, תרבית תאים כיתה |
| 14 מד נירוסטה קנית (2) 4 אינץ' | אספקת כללי מעבדה | 5-8365-1 | בלאנט נקודה |
מקורות
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assa....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
