Summary
Vi presenterar en mikroflödessystem tillvägagångssätt för uttrycket av proteinchip. Enheten består av tusentals reaktionskamrar kontrolleras av mikromekaniska ventiler. Den mikrofluidikanordning är parad med en mikromatris-tryckt genbibliotek. Dessa gener är sedan transkriberas och translateras på chip, vilket resulterar i en proteinarray klar för experimentell användning.
Abstract
Snabbt ökande områden, exempelvis systembiologi, kräver utvecklingen och genomförandet av ny teknik, vilket möjliggör hög kapacitet och hifi-mätningar av stora system. Mikrofluidik lovar att uppfylla många av dessa krav, som utför high-throughput screening experiment på chip, som omfattar biokemiska, biofysiska och cellbaserade analyser 1. Sedan början av mikrofluidik enheter har detta område utvecklats drastiskt, vilket leder till utveckling av mikroflödessystem storskalig integration 2,3. Denna teknik gör det möjligt att integrera tusentals mikromekaniska ventiler på en enda enhet med en porto-storlek fotavtryck (figur 1). Vi har utvecklat en hög genomströmning mikroflödessystem plattform för att generera in vitro-uttryck av protein kedjor (figur 2) som heter PING (proteininteraktioner Network Generator). Dessa arrayer kan tjäna som en mall för flera experimentsåsom protein-protein 4, protein-RNA-5 eller protein-DNA interaktioner 6.
Enheten består av tusentals reaktionskamrarna, som är individuellt programmeras med hjälp av en microarrayer. Justera dessa tryckta mikromatriser till mikrofluidik enheter program varje kammare med en enda fläck eliminerar eventuella föroreningar eller korsreaktivitet dessutom genererar microarrays med vanliga microarray observation tekniker är också mycket modulärt, vilket möjliggör grupperingsanordningen av proteiner 7, DNA 8, små molekyler, och även kolloidala suspensioner. De potentiella effekterna av mikrofluidik på biologiska vetenskaper är betydande. Ett antal mikrofluidik baserade analyser har redan nya insikter i struktur och funktion av biologiska system och inom mikrofluidik kommer att fortsätta att påverka biologi.
Protocol
1. Komponentframställning
- Inköpt DTPA-D SU-8 styrning mögel och SPR220-7 flöde mögel från Stanford Microfluidics Foundry ( www.stanford.edu / grupp / gjuteri ).
- Exponera silikon formar till klortrimetylsilan (TMCS) ånga under 10 minuter för att främja elastomer frigöring efter bakning stegen 9.
- Förbered en blandning av silikonbaserad elastomer och härdare (blanda väl) i två olika förhållanden 5:1 och 20:1 för kontroll och mögel flöde, respektive. De olika förhållanden är nödvändiga för riktig bindning av flera skikt.
- Häll 05:01 PDMS om kontroll lagret (ca 5 mm höjd). Avgasa kontroll skiktet och grädda den under 30 min vid 80 ° C. Spin coat (Laurell, USA) den 20:01 PDMS blandningen på flödet skiktet vid 2.600 rpm under 60 sekunder och sedan baka den vid 80 ° C under 30 minuter. Den spinnbeläggarens hastigheten är optimerad för ventilpåverkan vid ett tryckav 15 psi. Snabbare spinning kommer att resultera i ett tunnare skikt med lägre aktivering tryck och vice versa. Anordningarna vi använder har en gräns på 25 psi i kontrollen och 10 psi i flödet, över vilket lossnar från substratet kan inträffa.
- Separera kontrollen skiktet från formen. Gör det långsamt och vara noga med att inte skala SU8 mönster. Sedan skär enheten runt dess omkrets och hål punsch för att komma till styrkanaler.
- Rikta flödet och lagren kontroll manuellt under en stereoskop. Börja med att rikta det övre vänstra hörnet, den knappen ventilen (kontroll lagret) måste vara i mitten av reaktionskammaren (strömningsskikt). Därefter rikta den första raden och försiktigt släpp raden kontroll lagret för rad. Se till att alla knappen ventiler är i mitten av reaktionskamrarna och att adressuppgifterna och input ventiler korsa flödeskanalerna vid rätt position. Processen kan upprepas lokalt tills alla rader är inriktade. I slutet, släppa någon spänning i PDMS By lyfta den försiktigt från sidorna och hörn. Lyft inte för mycket eller felaktig inriktning kan förekomma.
- Baka det under 2 timmar vid 80 ° C.
- Skär runt omkretsen av anordningen och skala två skikt anordningen (chip) från flödet formen. Stansa hål för att komma till flödeskanalerna (figur 1).
2. DNA-ordnande och enhet Justering
- Framställa syntetiska gener genom montering PCR. De syntetiska generna komponera av T7-promotor, ribosombindningsställe (RBS), ORF med två epitopmärkningar (en vid varje ände), och T7-terminator 4. Generna kan variera i längd från 100 bp till, åtminstone, 5.000 bp.
- Förbered de syntetiska gener för ordnande: förbereda en blandning av polyetylen glycole (1,25%) och D-trehalosdihydrat (125 mg / ml) och fördela 2 pl per reaktion i 384 brunnar platta. Denna lösning minskar irreversibel bindning av DNA till glas samt för visualisering under uppriktning 10. Överför de syntetiska generna till 384 brunnars platta. Vanligtvis DNA-koncentrationer kan variera från 10 ng / pl till 100 ng / | il slutlig koncentration. Lägg dH 2 O till en slutlig volym av 20 pl (beroende på microarrayer och stifttyp).
- Spot en serie av syntetiska gener på epoxylackerad glassubstrat med en microarrayer. Vi använder mikronät 610 (Bio Robotics) med SMT-S75 silikon stift (parallell syntes, USA). Kontakt tryckning av DNA, med dessa specifika stift, resulterar i fläckar med en diameter av ca 100 | im på glasytan. Varje stift belastning räcker för cirka 100 platser. Se till kolumn och rad platser motsvarar den specifika använda enheten. Enheten använder vi innehåller 16 kolumner och 40 rader med en delning av 680 nm med 320 nm, respektive.
- Manuellt justera mikroflödessystem enheten till genen array under stereoskop. Den DNA-plats bör vara i mitten av DNA kamrarna. Börja anpassningen genom att placera den första raden av prickar Below den första raden av DNA kammare. Sedan sätta i linje resten av raderna avslutning med finjustering av hela enheten. När matrisen är inriktad försiktighet bör vidtas för att lindra eventuella spänningar i PDMS, genom att lyfta den lokalt. Om det finns spänning kvar i PDMS det kanske inte binda väl till microarray.
- Slutligen, binda anordningen till objektglaset genom inkubation över natten på en varm platta vid 80 ° C.
3. Priming och aktivera enheten
- Ventilerna i kontroll lagret påverkas från datorn med LabVIEW. Den LabVIEW skriptet kontrollerar en serie av magnetventiler mikro ventiler via en elektronisk styrbox (köpt från Stanford Microfluidics Foundry). Magnetventilen förgreningsröret är anslutet till komprimerad luft, som styr luftflödet och trycket i reglerventilerna på enheten.
- Anslut enheten till magnetventilerna grenröret med en flexibel plastslang med innerdiameter 0,02 "(Tygon) Och rostfritt stål stift (New England små rör Corporation).
- Fyll rören med DDW och sätt stiftet in i hålen åtkomst av kontrollen skiktet. Kontrollera att varje rör är ansluten till sin motsvarande styrkanal.
- Kör LabVIEW program på datorn för att aktivera styrkanaler. Genom att aktivera ventilen från LabVIEW skriptet, tillämpar vi lufttryck, vilket i sin tur kommer att driva vatten i PDMS styrkanalerna. Ställ lufttrycket till 5 psi. Det rekommenderas att fylla "sandwich" och ventilerna adress först för att identifiera korsvisa samtal mellan styrkanaler av defekta enheter. Vid korsvisa samtal kommer aktivering av "sandwich" styrledning leda till aktivering av antingen halsen eller knappen styrledningar. Detta liknar en kort i en elektrisk krets. En anordning med överhöming är defekt och kan inte användas.
- När alla styrkanalema och ventiler är fulla av DDW är ventilerna primas och ready att blockera strömningskanalerna under dem. Öka lufttrycket till 15 psi. Ventil aktivering styrs från en LabVIEW program genom en uppsättning av on / off-switchar är anslutna till enskilda magnetventiler. Varje omkopplare styr en viss kontroll linje genom dess motsvarande magnetventil. Slå på strömbrytaren knappen (i skriptet) kommer att gälla lufttrycket i motsvarande röret. Lufttrycket kommer att driva DDW i kontroll linje och kommer att resultera i expansion av mikroflödessystem ventiler, blockerar kanalen under. Stänga en styrventil, kommer att frigöra lufttrycket och sedan frigöra blockeringen av respektive flödeskanalen.
- För att säkerställa att alla ventiler är öppna, anslut en slang till en av flödet ingångar och flöde luft in i enheten vid 4-5 psi. Detta kommer att släppa några klibbiga ventiler från glasskiva.
- Slutligen är anordningen primas och klar. Stäng alla indata och "hals" ventiler, för att starta ytkemi.
- För att underlätta självorganisering av en protein-array på ytan och förhindra icke-specifik adsorption inom mikrofluidikanordning är ytan kemiskt modifierade:
- Att flöda en komponent genom anordningen, ansluter ett nytt rör med erforderlig lösning till en av flödeskanalerna i anordningen. Anslut den fria sidan av röret till den manuella fördelaren och öppna flödet lufttryck (5 psi).
- Ladda 40 | il av biotinylerat-BSA (1 ug / ul) i ett nytt rör och flöde ungefär hälften av det för 20 min genom anordningen, kommer BSA binder till epoxi ytan.
- Använd Hepes (50 mm) för att tvätta oreagerad substrat mellan alla de olika stegen ytkemi.
- Flöde 25 pl streptavidin (0,5 pg / pl) under 20 minuter på toppen av det biotinylerade-BSA.
- Tvätta med Hepes under 5 min.
- Stäng "knapp" ventil och flöda resten av det biotinylerade-BSA (som describädd ovan), passivering av ytan som omger knappen.
- Tvätta med Hepes under 5 min.
- Släpp "knapp" ventil och flöde 30 pl penta-His-biotin (0,16 ug / ul) under 20 min. Antikroppen kommer att binda till exponerade streptavidin, specifikt till området under "knapp" skapa en anti His-tag matris.
5. Protein Expression
- Uttrycka proteinerna på enheten med användning av kanin retikulocyt snabbt kopplad transkription och translation reaktion. Proteinuttryck från fläckiga syntetiska gener på enheten skapar en array av proteiner redo att använda. Till exempel, är en sådan användning för en proteinbindande skärm.
- Öppna "hals" ventiler och flöde kaninretikulocyt snabb kopplad transkription och translation reaktion genom enheten i DNA kammaren. Därefter stänger "sandwich" ventiler och separera varje gen från sin omgivning. Inkubera enheten på en varm platta under 2,5 timmar vid 30 ° C. Uttryckt proteins diffunderar från DNA kammaren till reaktionskammaren spontant (hals ventil är öppen) och binder till anti-His-antikropp under "knapp" ventil immobilisering av proteinet genom dess C-terminal tag.
- Märka proteinerna med C-myc-Cy3-antikropp. Antikroppen kommer att binda till dess motsvarande epitop belägen vid proteinnivån N-terminalen.
- Bestäm proteinnivåer uttryck med en microarray scanner (LS Reloaded, Tecan) med en 532 nm laser och 575 nm emissionsfilter.
6. Representativa resultat
1. Komponentframställning
En grafisk design för enheten skapades av AutoCAD utifrån våra experimentella behov. Designen trycktes på en OH-film med en högupplöst bild setter. Denna transparens fungerar som en fotomask i kontakt fotolitografi. En yt-mikrobearbetning teknik användes för att skapa 3-D mallar på en kiselskiva bestäms av mönstret inskrivna på than masker används.
Den mikrofluidikanordning tillverkades på silikon mögel gjutning polydimetylsiloxan silikonelastomer (PDMS, SYLGARD 184, Dow Corning, USA) (Figur 1). Varje enhet består av två inriktade PDMS lager, flödet och kontroll lagret. Formen först exponeras för klortrimetylsilan (TMCS, Aldrich) ånga under 10 minuter för att främja elastomer frigöring efter bakning steg. En blandning av silikonbaserad elastomer och härdningsmedel framställdes i två olika förhållande 5:1 och 20:1 för styrning och formarna flöde, respektive. Kontrollen skiktet avgasades och bakades under 30 minuter vid 80 ° C. Flödet skiktet initialt spinnbelades (Laurell, USA) vid 2.600 rpm under 60 sekunder och härdades vid 80 ° C under 30 minuter. Kontrollen separerades från sin form och styrkanal tillgång hål stansades. Därefter var flödet och kontroll skikt inriktade manuellt under ett stereoskop och bakades under 2 timmar vid 80 ° C. De två skikt anordningen skalades from flödet mögel och flödeskanaler tillgång hål stansades.
2. Device Description
Anordningen kapacitet kan variera från 500 upp till 10.000 enheter celler (figur 2). Enheten består av två skikt, strömningsskikt (grå) och kontroll lager (färg). Kontrollen skiktet innehåller en mängd av ventiler med olika funktion. Varje enhetscell, i flödet skiktet, består av en DNA-och en reaktionskammare och styrs av tre typer av mikromekaniska ventiler, "hals", "knapp", och "sandwich" (figur 2A). En fläckig 'syntetisk gen "avsatt inom DNA kammaren blockeras från reaktionskammaren genom" hals "ventil (grön). Svällning och mekanisk tvättning av ytan bundna proteiner i reaktionskammaren utföres av "knapp" ventil (blå). Den "sandwich" ventil möjliggör för varje reaktion att ske i en egen enhetscell (röd). Adressfälten ventiler kan dela enheten upp till 8 separata kretsar för different tillstånd analys. Dessutom, kontroll skiktet innehåller input ventiler som möjliggör flödet av valda vätska in i flödet skiktet. PDMS styrkanalema är fulla med DDW. När en ventil manövreras tryckökningen (15 psi) resulterar i expansionen av PDMS. På platser där membranet är tunt nog (dvs. korsning av kontroll och linjer flöde) är tillräcklig för att fullständigt blockera flödet linjen. Genomsnittlig Cellhöjden är 10 um, och den genomsnittliga enhet cellvolym är mindre än 1 NL.
3. Proteiner Expression och detektion
Proteiner uttrycktes på enheten med användning av kanin retikulocyt snabbt kopplad transkription och translation reaktion (Promega). Uttrycket av proteinerna skapade en matris av proteiner färdiga för användning i en bindande skärm (figur 3). Ett uttryck blandning (12,5 il) läses in i enheten och sedan strömmat in DNA kamrarna genom att öppna "hals" ventiler. Därefter var de "sandwich" ventilerstängd lämnar varje enhet cell skild från dess angränsande celler och enheten inkuberades på en värmeplatta under 2,5 timmar vid 30 ° C. Uttryckta proteiner diffunderat genom genen kammaren in i reaktionskammaren, där deras C-terminal His-markör kunde binda anti-His-antikropp (Qiagen) lokaliserad under "knapp" ventil immobilisering proteinet till ytan. Proteiner märktes med en C-myc-Cy3 (Sigma), som är bunden till dess motsvarande epitop belägen vid proteinnivån N-terminalen och märkt det. Protein uttrycksnivåer bestämdes med en microarray scanner (LS Reloaded, Tecan) med användning av en 532 nm laser och 575 nm filter. Det resulterande proteinet matris består av varierande nivåer av proteinuttryck. Vanligtvis, ca 20% av ett genbibliotek misslyckas att uttrycka detekterbara nivåer. Ingen korrelation med protein storlek observerades 3. Bakgrundsnivåer nivåer bestämdes med användning kammare som inte sågs med DNA. Sålunda, signaler från motsvarande protein kamrarna beror antingen nOise eller icke-specifik adsorption av märkningen antikroppar.
Figur 1. Chip Fabrication. (A) Formar behandlades med TMCS ångor för 10 minuter. (B) PDMS är gjuten på kontroll och flöden formar kisel. (C) både kontroll och formar flöde bakas i 80 ° C i 30 minuter. (D) Kontrollen lagret skalas av formen, tillskurna och kontroll inlopp stansas. (E) kontroll skiktet anpassas till flödet skiktet under ett stereoskop och sedan bakas i 80 ° C under 2 timmar. Parallellt med PDMS Komponentframställning är en serie syntetiska gener microarrayed på epoxylackerad glassubstrat (CEL Associates). (F) Enheten sedan anpassas till DNA microarray fånga de "syntetiska gener" i DNA kammare.
Figur 2. Ett foto av PING-enheten. (A) Enheten consist av två inriktade PDMS lager (kontroll och flöde). Flödet lagret innehåller parallella DNA och reaktion kammare (grå) som kontrolleras av mikromekaniska ventiler ("knappen", "sandwich" och "hals") i kontrollgruppen lagret. (B) Skikten är inriktade på ett tryckt microarray, vilka program varje DNA kammare med en enda fläck. Detta eliminerar eventuella föroreningar.
Figur 3. Fluorescerande bilder av ett protein array Skapad med en mikroflödessystem chip. De tryckta plats gener uttrycktes till proteiner i enheten (i DNA kammaren) och revs till ytan (under "knappen" ventil i reaktionskammaren) genom deras C-terminalen His-markör. Protein uttryck detekterades med användning av deras C-myc N-terminalen tagg och en specifik fluorescerande antikropp. Olika signalintensiteter visar olika protein uttryck. Un-prickig kammare tjänade som kontroller för bakgrund leVels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta papper presenterar vi en metod för arrayer generationens protein i hög genomströmning med en mikroflödessystem plattform. Matrisen generationen är baserad på microarray tryckning av DNA-mallar och in vitro-proteinexpression från DNA inuti mikrofluidanordningen.
Vår nya mikroflödessystem plattform har flera viktiga fördelar jämfört närvarande använda metoder som gör det till en lovande och allmänt verktyg för proteomik. En fördel är med membranbundna proteiner. In vitro proteinsyntes med däggdjur retikulocyt lysat i närvaro av mikrosomala membran 11 ger "naturlig som" villkoren för membranproteiner. Vidare medger mikrofluidik för proteinexpression i mycket låga volymer och proteinrening är inte nödvändigt. Dessa är de vanligaste flaskhalsarna i konventionella metoder. I själva verket kan ytterligare optimering av proteiner erhålls genom att matcha in vitro celL lysat till proteinerna, exempelvis E. coli-lysat för bakteriella proteiner.
Mikrofluidik möjliggör proteinuttryck i mycket låga volymer. I vårt speciella exempel kammarvolymen är 1 nl. Det finns två fördelar med att de låga volymerna. Den uppenbara en är lägre förbrukning av reagens och förmåga att arbeta med sällsynta material (t.ex. membranproteiner). En annan betydande fördel är att koncentrera proteinerna på ytan med antikroppar i en så liten volym tillåter oss att uppnå relativt höga koncentrationer av proteiner för interaktion analyser, vilket kommer att öka analyskänsligheten.
Knappen Ventilerna har dubbla roll. Först de används för mönstring av en antikropp under knappen i varje kammare. Detta tillåter oss att dra ner de proteiner endast under knapparna, medan resten av kammaren passiveras. Det andra, knapparna medger mekanisk tvättning och infångning av proteinerna genom att förskjuta en vätskevolymunder när den påverkas. Denna tvättning och svällning ökar den totala känsligheten av plattformen och tillåter detektion av svaga och övergående molekylära interaktioner 4.
Slutligen kan mikrofluidanordningen lätt automatiseras och kan göra många parallella mätningar. Vilket sparar kostnader och tid. Vår bedömning är att kostnaden per protein experiment med PING är ca 2 cent per protein, med nuvarande utrustning på upp till 10.000 försök per enhet 4. Denna uppskattning omfattar tillverkning och material. Sålunda har PING potential att bli ett kraftfullt verktyg för proteinchip i allmänhet med specifika fördelar såsom membranproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Marie Curie International återintegreringsbidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ESSEX-DC | |
| Chlorotrimethylsilane (TMCS | Sigma-Aldrich | C72854 | |
| Epoxy coated glass substrates | CEL Associates USA | VEPO-25C | |
| Poly ethylene glycole (PEG) | Sigma-Aldrich | 81260 | |
| D-trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531 | |
| Biotinylated-BSA | Pierce, Thermo Scientific | PIR-29130 | |
| Neutravidin | Pierce, Thermo Scientific | 31050 | |
| penta-His-biotin | Qiagen | 34440 | |
| Hepes |  Biological Industries |
03-025-1B | |
| TNT-T7 | Promega Corp. | L5540 | |
| C-myc Cy3 antibody | Sigma-Aldrich | ||
| Control box | Stanford Microfluidics Foundry | ||
| Mold | Stanford Microfluidics Foundry | ||
| Pin | New England Small Tubes Corporation | ||
| Tygon microbore tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Microarrayer | Bio Robotics | MicroGrid 610 | |
| Silicone pins | Parallel Synthesis | SMT-S75 |
References
- Maerkl, S. J. Integration column: Microfluidic high-throughput screening. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).
- Hong, J. W., Quake, S. R. Integrated nanoliter systems. Nature. 21, 1179-1183 (2003).
- Unger, M. A Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nature. 6, 71-74 (2009).
- Einav, S. Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological inhibitors by microfluidic affinity analysis. Nature. 26, 1019-1027 (2008).
- Fordyce, P. M. De novo identification and biophysical characterization of transcription-factor binding sites with microfluidic affinity analysis. Nature Biotechnology. 28, 962-967 (2010).
- Zhu, H. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science (New York, N.Y.). 293, 2101-2105 (2001).
- Ramachandran, N. Self-assembling protein microarrays. Science (New York, N.Y.). 305, 86-90 (2004).
- Zhong, J. F. A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells. Lab on a chip. 8, 68-74 (2008).
- Kusnezow, W., Hoheisel, J. D. Solid supports for microarray immunoassays. Journal of molecular recognition JMR. 16, 165-176 (2003).
- Lundin, M., Monne, M., Widell, A., Von Heijne, G., Persson, M. A. A. Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B. Journal of virology. 77, 5428 (2003).
