ربط المسابر البيولوجي لأجهزة الاستشعار البصرية عن طريق وكلاء السيليكا اقتران silane

Summary

أجهزة الاستشعار التفاعل مع البيئات المعقدة والبيولوجية وإجراء الكشف المستهدفة من خلال الجمع بين أجهزة استشعار حساسة للغاية مع تحقيقات محددة للغاية التي تعلق على الاستشعار عن طريق تعديل السطح. هنا، علينا أن نبرهن على سطح functionalization من أجهزة الاستشعار البصرية السيليكا مع البيوتين استخدام وكلاء اقتران silane لسد استشعار والبيئة البيولوجية.

Abstract

من أجل التفاعل مع البيئات البيولوجية، ومنصات جهاز الاستشعار البيولوجي، مثل نظام Biacore شعبية (على أساس مأكل سطح الرنين (SPR) تقنية)، والاستفادة من مختلف تقنيات التغيير في السطح، والتي يمكن، على سبيل المثال، منع تلوث السطح، وتوليف hydrophobicity / hydrophilicity من السطح، والتكيف مع مجموعة متنوعة من البيئات الإلكترونية، والأكثر شيوعا، وتحدث خصوصية من أجل التوصل إلى الهدف من الفائدة. ^1-5 هذه التقنيات توسيع وظيفة من أجهزة الاستشعار وإلا حساسة للغاية إلى التطبيقات في العالم الحقيقي في بيئات معقدة، مثل كما الدم والبول، وتحليل مياه الصرف الصحي. ^2،6-7 بينما منصات biosensing التجارية، مثل Biacore، وغير مفهومة بشكل جيد، وتقنيات قياسية لأداء هذه التعديلات السطحية، إن لم تكن هذه التقنيات تترجم بطريقة موحدة لغيرها من التسمية مجانا منصات biosensing، مثل معرض يهمس وضع (WGM) مرنانات بصري. ^8-9 < / P>

مرنانات WGM البصرية تمثل تكنولوجيا واعدة لأداء التسمية خالية من الكشف عن مجموعة واسعة من الأنواع في تركيزات منخفضة للغاية ^6،10-12 حساسية عالية من هذه المنصات هي نتيجة للبصريات بهم هندسية فريدة من نوعها:. WGM بصري مرنانات تحصر تداول . في ضوء معين، ترددات الرنين لا يتجزأ ¹³ وعلى غرار منصات SPR، لا مجال بصري يقتصر كليا على جهاز الاستشعار، ولكن evanesces، وهذا "ذيل زائل" يمكن أن تتفاعل ثم مع الأنواع في البيئة المحيطة. هذا التفاعل يتسبب في معامل الانكسار الفعال لمجال بصري إلى تغيير، مما أدى إلى طفيفة، ولكن يمكن اكتشافها، والتحول في وتيرة صدى للجهاز. لأن الحقل البصري يدور، ويمكن ان تتفاعل عدة مرات مع البيئة، مما أدى إلى تضخيم المتأصلة في الإشارة، والحساسيات عالية جدا إلى تغييرات طفيفة في البيئة. ^2،14-15

خيمة "> لإجراء الكشف استهدفت في بيئات معقدة، ويجب أن تقرن هذه المنصات مع جزيء مسبار (عادة نصف من زوج ملزم، على سبيل المثال الأجسام المضادة / المستضدات) من خلال تعديل السطح. ² على الرغم من أن تكون ملفقة مرنانات WGM البصرية في هندستها عدة من مجموعة متنوعة من النظم المادية، microsphere السيليكا هو الأكثر شيوعا. هذه المجهرية هي ملفقة بشكل عام على نهاية الألياف الضوئية، والتي تنص على "الجذعية" التي يمكن من خلالها التعامل مع المجهرية خلال التجارب functionalization والكشف. قد كيمياء سطح السيليكا يمكن تطبيقها على تعلق جزيئات التحقيق على سطوحها، ولكن الأساليب التقليدية، ولدت لركائز مستو غالبا ما تكون غير كافية لهذه الهياكل ثلاثي الأبعاد، وأية تغييرات على سطح المجهرية (الغبار والتلوث، والعيوب السطحية، والطلاء متفاوت) يمكن أن يكون شديد، عواقب سلبية على قدرات الكشف عنها، وهنا علينا أن نبرهن مقاربة سطحيةلfunctionalization سطح microsphere السيليكا مرنانات WGM البصرية باستخدام silane كلاء اقتران لسد سطح غير العضوية والبيئة البيولوجية، عن طريق ربط البيوتين إلى السطح السيليكا. ^8،16 على الرغم من أننا استخدام مرنانات السيليكا WGM microsphere مثل نظام الاستشعار في هذا التقرير، البروتوكولات هي عامة ويمكن استخدامها لfunctionalize سطح أي جهاز السيليكا مع البيوتين.

Protocol

1. خلفية

ويرد على البيوتين إلى السطح من هذه الأجهزة من خلال عملية بسيطة من ثلاث خطوات، (الشكل 1). أولا، علينا تنظيف السطح وملء مع مجموعات الهيدروكسيل من خلال تعريض الأجهزة إلى بلازما الأوكسجين أو حل سمكة البيرانا. الثانية، ونحن نستخدم ترسيب البخار تولي وكيل اقتران silane إنهاء مع الأمينات الأولية للمجموعات الهيدروكسيل من خلال رد فعل التحلل المائي والتكثيف. الثالثة، ونحن نعلق البيوتين إلى السطح عن طريق N-hydroxysuccinimide (NHS) كيمياء استر. نوجه القارئ المهتم في عملنا السابق لمزيد من المعلومات عن تطور هذه التقنيات، وكذلك شرحا لدينا الدافع لاختيار هذه التقنيات. ⁸

ويمكن تقييم نجاح هذه التفاعلات من خلال المجهر الضوئي ومضان بعد إضافة لأمين الابتدائية، وكذلك بعد إضافة البيوتين. بينما بصري مويمكن استخدام icroscopy لتحديد ما إذا البروتوكولات functionalization سطح أدى إلى الأضرار التي لحقت سطح microsphere، أو حتى التلوث، وتستخدم مضان المجهري للتحقق من جودة والتوحيد من تغطية سطح جزيء البيوتين، وكذلك قدرة على البيوتين السطح لربط مع (strept) أفيدين. لتقييم تغطية الأمينات على السطح، كنا فلوريسئين الفصيلة (FITC) صبغة الفلورسنت، والتي تتفاعل مع الأمينات الأولية لتشكيل مستقرة، والربط ثيويوريا التساهمية إلى microsphere. وتستخدم تكساس الاحمر صبغة الفلورسنت التي كانت مترافق إلى أفيدين لتسمية المجموعات البيوتين على السطح من خلال التفاعل البيوتين أفيدين. في كلتا الحالتين، تم اختيار الأصباغ التي يمكن أن تتفاعل (من خلال التفاعلات مستقبلات يجند أو الرابطة التساهمية) مع المجموعات الوظيفية على السطح.

هنا، وكيل اقتران silane، التي لديها ثلاث مجموعات وترك مجموعة واحدة وظيفية، ويوفر جسر الرهانوين سطح العضوية وغير العضوية جزيء التحقيق. وظيفة أمين الابتدائية يتفاعل كميا مع استرات NHS على شكل سندات أميد مستقر. في هذه الحالة، ونحن نستخدم جزيء التحقيق البيوتين الذي valeric سلسلة الجانب تم تعديل مع مجموعة استر NHS. واقعيا، لا يمكن تحقيق أي الجزيء الذي يمكن إضافة مجموعة استر NHS إلى السطح باستخدام البروتوكولات التالية. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه البروتوكولات هي عامة، ويمكن استخدامها لfunctionalize أي سطح جهاز السيليكا مع البيوتين.

التحدي الرئيسي مع هذه البروتوكولات ليست في الواقع في الكيمياء حد ذاته، بل في طريقة التعامل مع السيليكا المجهرية. يرجى ملاحظة أن، في جميع أنحاء البروتوكولات، وينبغي التعامل مع المجهرية بواسطة grapsing جذوعهم بخفة مع حادة ذات الرؤوس ملاقط. هذا يحافظ على ملاقط بعيدا عن المجهرية أنفسهم، ويسمح لسهولة النقل بين الخطوات. صممت خصيصا العديد من الخطوات في هذا البروتوكول دون التصدي لهذه الحقيقةأو.

2. Microsphere تلفيق

1. بناء مساكن للتخزين المجهرية.
   1. باستخدام سكين exacto، قطع ¼ في قطعة سميكة من الورق المقوى إلى 1 في × 1 في مربع، وهذا الشريط على شريحة زجاجية بحجم عادي، ونعلق 1 في قسم من لاصق شفاف، مع أهدافها تلبية لتشكيل لفة ، على الورق المقوى.
   2. وهذا يخلق المنصة التي يمكن أن تكون مرتفعة في microsphere وعزله عن البيئة المحيطة بها، ويمنع الضرر على سطحها.
2. باستخدام مقص، وقطع الباب 3 بوصة من الألياف البصرية من بكرة من الألياف البصرية.
3. باستخدام متجرد من الألياف لا، نيك، تجريد طلاء واقية البوليمرية من 0.5 بوصة الأخيرة من نهاية قطعة قطع من الألياف، وترك مجرد نواة السيليكا. قم بتنظيف السطح من أي البوليمر المتبقي مع Kimwipe مع الميثانول بواسطة المسح برفق الألياف مع Kimwipe.
4. باستخدام الألياف الساطور العارية، وتقليم نهاية جردت حتى السابعةفي حوالي 1 ملليمتر فقط من الألياف جردت يبقى على نهاية الألياف.
5. وضع حد تجريده من الألياف البصرية في طريق ليزر CO _2، مع الحرص على محاذاة عموديا على الألياف مثل أن نهايته تجريد لأسفل.
6. بدوره على ليزر CO _2، وتوجيهها إلى السطح في نهاية تجريده من الألياف البصرية. سوف تذوب في نهاية الليزر تجريده من الألياف في مجال استخدام الطاقة ما يقرب من 3.5٪ في 2 ثانية.
7. باستخدام الملقط، بعناية فهم الجذعية (الجزء غير تجريده من الألياف البصرية) من microsphere. نعلق الجذعية للفة الشريط على السكن microsphere. ويمكن لشريحة زجاجية نفسها المخزنة في طبق بيتري. وهذا يسمح للتخزين الآمن للmicrosphere.

3. ملء السطح مع مجموعات الهيدروكسيل

1. باستخدام حل سمكة البيرانا:
   1. في قارورة البولي بروبلين 60 مل مع غطاء يتوقف، يعد حل سمكة البيرانا (70:30 بواسطة حجم دخن H 4: H ₂ O ₂ (30٪ بالوزن)) وذلك بإضافة 5 مل من بيروكسيد الهيدروجين على القارورة، يليه بنسبة 11.6 مل من حمض الكبريتيك دخن. تنبيه: ارتداء أحمضة قفازات.
   2. نقل الشريحة الزجاجية، وعقد لا يقل عن 1 microsphere، إلى القارورة. يجب أن microsphere تكون على اتصال مع السائل، ولكن السائل لا ينبغي أن تلمس الورق المقوى. ضبط مستوى الصوت من الحل إذا لزم الأمر.
   3. إزالة بلطف الشريحة من زجاج القارورة، وأدخلها في آخر قنينة بلاستيكية تحتوي على DDI H ₂ O. السماح لعينات من الجلوس في حل لمدة 5 دقائق.
   4. إزالة بلطف الشريحة من زجاج القارورة، ووضعه في الفرن 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق حتى يجف السطح.
2. باستخدام الأوكسجين علاج البلازما:
   1. نقل الشريحة الزجاجية التي تحتوي على واحد على الأقل microsphere إلى الأكسجين غرفة البلازما.
   2. ضبط ضغط الأكسجين إلى 200 mTorr، والقوة إلى 120 دبليو تعرض العينة إلى بلازما الأوكسجين عن 2 ميلnutes.
   3. إزالة شريحة زجاجية من غرفة البلازما.

4. ربط وكلاء اقتران silane إلى السطح

1. وضع شريحة زجاجية، التي تحتوي على واحد على الأقل microsphere، في مجفف فراغ في غطاء الدخان.
2. أيضا في غطاء محرك السيارة دخان، فتح وكيل اقتران silane زجاجة (في هذه الحالة، كان يستخدم aminopropyltrimethoxysilane (APTMS))، ووضع زجاجة افتتح في مجفف.
3. استبدال غطاء على مجفف فراغ، وإرفاق المنفذ منفذ إلى الشافطة أو منزل خط فراغ.
4. بدوره على فراغ منزل أو خط المياه، وإخلاء مجفف فراغ. بمجرد تشكيل ختم فراغ بين غطاء وقاعدة، تبدأ توقيت رد فعل. وهذه الودائع وكيل اقتران silane على السطح باعتبارها طبقة رقيقة.
5. بعد 15 دقيقة، وإيقاف فراغ، وفتح الميناء ببطء للسماح للهواء في مجفف. لهذا وكيل اقتران، 15 دقيقة كافية لتشكيل unifoRM أحادي الطبقة على السطح. عن وكلاء اقتران أخرى، ربما يكون الوقت هناك حاجة الى تعديلها.

5. ربط البيوتين إلى السطح

1. ما يقرب من ساعة واحدة قبل ربط البيوتين، ويعد حل 10 ملم من N-hydroxylsuccinimide البيوتين (NHS-البيوتين) في dimethylsulfoxide اللامائية (DMSO) في قارورة البولي بروبلين 60 مل مع غطاء يتوقف.
   1. إذا كان قد تم تخزين NHS-البيوتين الباردة، وتسمح لها تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة قبل حشد من ذلك.
   2. يصوتن الحل لمدة 1 ساعة إلى حل بشكل كامل مسحوق NHS-البيوتين في المذيب.
2. نقل الشريحة الزجاجية التي تحتوي على microsphere إلى آخر قنينة بلاستيكية، مع المجهرية في الجزء السفلي، وينطلق في الجزء العلوي من القارورة.
3. نقل، وذلك باستخدام الماصة البلاستيكية، وحجم مناسب من الحل NHS-البيوتين أسفل الجانب من القارورة، وراء الشريحة الزجاجية (وبالتالي فإن الحل لا تلمس microsphere كما يتم إضافته إلى القارورة). ADD حل بما يكفي لتغطية سطح microsphere.
4. ضع قارورة تحتوي الآن على المجهرية وNHS البيوتين في حل DMSO على حاضنة هزاز (علبة الخيمة) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع سرعة وزاوية الميل في الساعة 5 دورة في الدقيقة ودرجة 5 على التوالي.
5. إزالة بلطف الشريحة من زجاج القارورة، وحرك برفق إلى آخر قنينة مليئة ₂ DDI O. H وضع قنينة على علبة الخيمة لمدة 10 دقيقة في نفس السرعة وزاوية الميل كما كان من قبل. كرر هذه الخطوة مرتين مع المياه العذبة في كل مرة. هذا يساعد على إزالة DMSO الزائدة من على سطح الأرض، ويزيل أي البيوتين بدنيا، كثف التي لم الكسب غير المشروع في الواقع إلى السطح.
6. إزالة شريحة زجاجية من القارورة، ووضعه في الفرن على 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، أو حتى يتم إزالة جميع قطرات الماء من على سطح الأرض.

6. فلوري توسيم أمين منتهية السيليكا

1. لتسمية المجموعات أمين الحالي بعد treatmوالأنف والحنجرة مع APTMS، وإعداد حل FITC في غرفة مظلمة عن طريق إذابة 1 ملغ FITC في 1 DMSO اللامائية مل.
2. تمييع الحل في 6.1 بإضافة 50 ميكرولتر من الحل FITC إلى 1 مل من 0،1 M الصوديوم بيكربونات العازلة.
3. وضع الحل في قارورة البولي بروبلين 60 مل مع غطاء يتوقف، وحرك بلطف المجهرية أمين منتهية، يضم مرة أخرى على شريحة زجاجية، في قارورة.
4. وضع قنينة في حمام الثلج، والسماح للعينة تتفاعل مع الحل FITC مدة لا تقل عن 4 ساعات في الظلام.
5. إزالة fluorophore الزائدة من خلال اثنين من يشطف 10، دقيقة من المجهرية في عازلة كربونات الصوديوم. كما كان من قبل، وملء قارورة البولي بروبلين 60 مل مع غطاء يتوقف مع المخزن المؤقت، وحرك بلطف الشريحة الزجاجية الى حل، مع الحرص على أن الحل لا يغطي سوى microsphere، وليس على السكن من الورق المقوى. تغطية قارورة مع رقائق الألومنيوم، ووضع قنينة على صينية الخيمة التي وضعت في 5 درجات، ودورة في الدقيقة 5، كما كان من قبل.
6. إزالة بلطف الشريحة من زجاج القارورة، وحرك برفق إلى آخر قنينة مليئة ₂ DDI يا H ومغطاة بورق الألومنيوم. وضع قنينة على علبة الخيمة لمدة 10 دقيقة في نفس السرعة وزاوية الميل كما كان من قبل. كرر هذه الخطوة مرتين مع المياه العذبة في كل مرة. هذا يساعد على إزالة الصبغة الزائدة من على سطح الأرض.
7. إزالة بلطف الشريحة من زجاج القارورة، وجاف في فرن حدد في 80 م لمدة 10 دقائق قبل التصوير.

7. فلوري وضع العلامات من البيوتين منتهية السيليكا

1. مخزنة يعد حل 10 ميكروغرام / مل من تكساس الأحمر أفيدين في الفوسفات المالحة.
2. إضافة إلى حل قارورة البولي بروبلين 60 مل مع غطاء يتوقف، وحرك بلطف الشريحة الزجاجية التي تحتوي على البيوتين microsphere منتهية إلى الحل، بحيث يتم تغطية سوى microsphere بواسطة الحل.
3. رد فعل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
4. إزالة fluorophore الزائدة من خلال اثنين و 10 دقيقة شطفق من المجهرية في العازلة في برنامج تلفزيوني.
   1. كما كان من قبل، وملء قارورة البولي بروبلين 60 مل مع غطاء يتوقف مع المخزن المؤقت، وحرك بلطف الشريحة الزجاجية الى حل، مع الحرص على أن الحل لا يغطي سوى microsphere، وليس على السكن من الورق المقوى.
   2. تغطية قارورة مع رقائق الألومنيوم، ووضع قنينة على صينية الخيمة التي وضعت في 5 درجات، ودورة في الدقيقة 5، كما كان من قبل.
5. إزالة بلطف الشريحة من زجاج القارورة، وحرك برفق إلى آخر قنينة مليئة ₂ DDI يا H ومغطاة بورق الألومنيوم. وضع قنينة على علبة الخيمة لمدة 10 دقيقة في نفس السرعة وزاوية الميل كما كان من قبل. كرر هذه الخطوة مرتين مع المياه العذبة في كل مرة. هذا يساعد على إزالة الصبغة الزائدة من على سطح الأرض.
6. إزالة بلطف الشريحة من زجاج القارورة، وجاف في فرن وضعت في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل التصوير.

8. ممثل النتائج

functionalized بشكل صحيح microsphereويمكن تحديد الصورة من خلال المجهر الضوئي ومضان. إذا تتم functionalization سطح بشكل صحيح، فإنه ينبغي أن يؤدي إلى تغطية كثيفة بشكل موحد من جزيئات البيوتين على السطح، والسطح يجب أن يبقى عيب، وخالية من الملوثات بعد functionalization من أجل الحفاظ على الحساسيات العالية خلال التجارب التي كشف. ويمكن استخدام المجهر الضوئي للتحقيق في هذه الأخيرة، في حين فلوري المجهر يمكن تحقيق الجودة والاتساق في تغطية السطح. في الشكل 2، وتبين لنا أمثلة من المجهرية functionalized بشكل صحيح. هذه الصور تبين أنه لا يوجد أي ضرر أو تلوث سطح بسبب functionalization (الشكل 2A)، وتبين أن المجهرية موحد، والتغطية تتفق الجماعات أمين إما (الشكل 2B) أو مجموعات البيوتين (الشكل 2C) على السطح .

إذا لم يتم المجهرية functionalized بشكل صحيح، والصور الضوئية microsphere وايسوف يحمل تلوث السطح، وتغطية تكتل أو غير موحدة، والعيوب الواضحة في السطح، مثل الشقوق السطحية (الشكل 3). هنا، ونحن نرى من الأمثلة الشائعة من التلوث السطحي، والناجمة عن تكتل من الكواشف على السطح.

الشكل 1. 3-الخطوة رد فعل مخطط لربط جزيئات مسبار على سطح المجهرية السيليكا. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2. المجهرية السيليكا. 1 صورة مجهرية) بصري من microsphere السيليكا ملؤها مع مجموعات الهيدروكسيل عن طريق التعرض للبلازما الأوكسجين ب) مجهرية نيون من microsphere السيليكا ملؤها مع الأمينات الأولية وصفت مع صبغ FITC ج) صورة مجهرية نيون مي السيليكاcrosphere ملؤها مع البيوتين وصفت مع تكساس الأحمر أفيدين المتقارن. أعيد طبعها بإذن من Soteropulos، CE، هانت، هونج كونج وأرماني، صباحا تحديد حركية ملزم باستخدام يهمس microcavities وضع معرض. تطبيق ورقة. فيز. بادئة رسالة. 99، 103703-103703 (2011). حقوق الطبع والنشر 2011، المعهد الأمريكي للفيزياء ^(17).

الشكل 3. صورة مجهرية من المجال البصري functionalized بشكل غير صحيح. هنا، يمكنك ان ترى الغبار على سطح اعلى اليمين، فضلا عن تلوث تمتد من السطح. بالإضافة إلى ذلك، الجانب الأيمن من microsphere بصري يظهر و divot صغيرة على السطح.

Discussion

كما هو موضح في البروتوكولات، وأنشأنا منصة المساكن التي يمكن من خلالها نقل المجهرية السيليكا بواسطة ينبع لها في جميع مراحل عملية functionalization. تم إنشاء هذا المنبر السكن وإيجاد حل لتلوث المياه السطحية والأضرار التي نجمت عن microsphere ملامسة الجدران من الحاويات المختلفة المستخدمة في جميع مراحل عملية functionalization. أدركنا أن الصعوبة الرئيسية نشأت عن ربط باستمرار وفصل المجهرية الفردية لحاويات مختلفة أثناء عملية functionalization. كان من الصعب تجنب بالفرشاة على microsphere ضد كائن عندما تتحرك كل على حدة مع ملاقط بواسطة التمسك ينبع. عن طريق تثبيت موقف كل microsphere على الشريحة الزجاجية، كنا قادرين على التحرك بكل بساطة عددا من المجهرية ويخرجون من حاويات مختلفة من التعامل مع شريحة زجاجية، وليس تنبع من microsphere. بهذه الطريقة، كنا قادرين على functionalize العديد من هذه ديفالثلوج في نفس الوقت، ونحن لازلنا التلوث والأضرار الناجمة عن التعامل مع سطح غير لائق، مما أدى إلى نجاح ~ نسبة 90٪ من خلق لم يلحق بها أذى، functionalized المجهرية.

كما ورد في البروتوكولات، واكتشفنا طريقتين يمكن من خلالها للhydroxylate المجهرية السيليكا. في حين يشيع استخدام سمكة البيرانا حل لهذا، يمكن أن يكون مضيعة للوقت، ويتطلب الكيمياء الرطبة. لاحظنا عند العمل مع المجهرية، تفوق الهيدروكسيل من خلال معالجة بلازما الأوكسجين. الأوكسجين علاج البلازما لا يتطلب أي اتصال مع حلول السائل، والتجفيف لا، وليس التعامل مع السيليكا المجهرية. بالإضافة إلى ذلك، بل هو عملية أسرع بكثير لملء السطح مع مجموعات الهيدروكسيل. ومع ذلك، فإننا ندرك أنه ليس كل مجموعة البحث والحصول على معدات بلازما الأوكسجين، وبالتالي قد تحتاج إلى استخدام حل سمكة البيرانا لتشكيل وظائف المطلوبة الهيدروكسيل. فإن استخدام إما يؤدي إلى تشكيل مجموعات الهيدروكسيل علىالسطح.

الوقاية من التلوث أثناء functionalization السطح قضية كبرى، ولكن يمكن التقليل من قبل التزام الحرص على البروتوكولات. الأسباب الأكثر احتمالا للتلوث وسوء المناولة خلال functionalization، فضلا عن غسل غير صحيح أو غير دقيق، من على السطح بعد كل خطوة من الخطوات رد فعل. هذا هو الحال بصفة خاصة خلال هذه الخطوة أول رد فعل، حيث يتم ملؤها السطح مع مجموعات الهيدروكسيل. إذا تم اختيار سمكة البيرانا حل لهذا الأسلوب، يجب الحرص على إزالة تماما أي حمض الكبريتيك من على سطح الأرض، وحتى يجف تماما وmicrosphere، والسطح هو الآن ماء للغاية، والمياه من يشطف يتمسك إلى السطح. إذا حامض الكبريتيك يبقى على السطح، وmicrosphere يصبح "لزجة" والغبار من البيئة مختبر يجمع على السطح بسهولة أكبر. بالإضافة إلى ذلك، قطرات الماء على السطح يؤدي إلى وكيل اقتران silane للتجمع في منطقة واتإيه قطرات، وتشكيل غلوب السيليكا البوليمرية، والتي ينظر اليها على التثاقل في الميكروسكوب فلوري. إذا تكتل سطح يحدث بالفعل، فإنه يمنع microsphere من أن تستخدم في الكشف عن التجارب، وذلك بسبب انخفاض كبير في حساسية الجهاز. عادة، عندما يتم استخدام الأكسجين العلاج البلازما، ويتم التقليل من تكتل سطح، فضلا عن التلوث،. ومع ذلك، ليس كل مختبر لديه حق الوصول إلى هذه المعدات، وذلك باستخدام حل سمكة البيرانا قد يكون ضرورة.

أخيرا، وجدنا أنه من الضروري يصوتن الحل NHS-البيوتين قبل استخدامها في حل تماما NHS-البيوتين في DMSO. عندما تم تخطي هذه الخطوة، فإن نظام التأمين الصحي، البيوتين إيداع على السطح في كتل كبيرة عن طريق امتصاص المادية، وليس ملزما تساهمي إلى السطح. هذه كتل كبيرة من الصعب للغاية لإزالة خلال خطوات الغسيل، ولكن يمكن الوقاية منها عن طريق تشتيت السليم خلال حل الأولية. ساعة واحدة تكفي عادة لهذا الغرض؛ومع ذلك، إذا يتم توسيع هذه الإجراءات لجزيئات التحقيق محورة أخرى مع مجموعات استر NHS، ونحن نوصي تقييم الحل عبر تشتت الضوء الحيوي لضمان حل كامل.

البروتوكولات بالتفصيل هنا تمثل خطوة إلى الأمام في ترجمة مستو كيمياء سطح السيليكا إلى ثلاثي الأبعاد الأجهزة، حيث نوعية التغطية سطح وسطح جهاز لا تقل أهمية عن استخدام النهائي للأجهزة. وأظهرت المجهرية functionalized تماما عندما يتم استخدام هذه البروتوكولات، والتغطية الكثيفة موحد للجزيء التحقيق، مع عدم وجود تلوث أو تراكمها على السطح. هذه التغطية سطح موحدة تسمح للحفاظ على الحساسيات عالية عندما يتم استخدام هذه الأجهزة في التجارب كشف. استخدام وكلاء اقتران silane كجسر بين الركيزة غير العضوية والبيولوجية للجزيء التحقيق هو بسيط ومباشر، ويمكن استخدامها، وخصوصا مع تفهم جيدا (وج جداommon) NHS استر والكيمياء، وجهاز الاستشعار البيولوجي لملء السطوح البصرية مع جزيئات التحقيق من مختلف الأنواع.