Установка биологической зонды для кварцевых оптических биосенсоров использованием силана связующие вещества

Summary

Биосенсоры взаимодействовать со сложными биологическими средами и выполнение целевого обнаружения, комбинируя высокочувствительные датчики с высокой специфичностью датчиков прилагается к датчику с помощью модификации поверхности. Здесь мы демонстрируем поверхности функционализации кварцевых оптических датчиков с использованием биотина силана связующие вещества для преодоления датчика и биологической среды.

Protocol

1. Фон

Биотин крепится к поверхности эти устройства с помощью простого, три этапа (рис. 1). Во-первых, очистить поверхность и заполните ее гидроксильных групп, подвергая устройства или кислородной плазмы или пиранья решение. Во-вторых, мы используем осаждения паров приложить силана средство связи прекращаются с первичным амином на гидроксильные группы путем гидролиза и реакции конденсации. В-третьих, мы придаем биотина на поверхность с помощью N-гидроксисукцинимида (NHS) эфир химии. Мы направляем заинтересованного читателя к нашей предыдущей работы для получения дополнительной информации о развитии этих технологий, а также объяснение нашей мотивацией для выбора этих методов ^8.

Успех этих реакций может быть оценена с помощью оптической и флуоресцентной микроскопии после того первичного амина, а также после добавления биотина. В то время как оптический мicroscopy могут быть использованы для определения протоколов поверхность функционализации привело к повреждению поверхности микросфер, или даже загрязнений, флуоресцентная микроскопия используется для проверки качества и равномерности покрытия поверхности молекулы биотина, а также способности биотина на поверхность, с которой связывается (strept) авидин. Для оценки охвата аминов на поверхности, мы использовали флуоресцеин изотиоцианат (FITC) флуоресцентного красителя, который реагирует с первичными аминами с образованием стабильных, ковалентная связь тиомочевины в микросферы. Texas Red флуоресцентного красителя, который был сопряженных с авидином используется для обозначения группы биотина на поверхность через биотин-авидин взаимодействия. В обоих случаях, красители были выбраны, которые могут взаимодействовать (либо через рецептор-лиганд или ковалентной связи) с функциональными группами на поверхности.

Здесь силана агента связи, которая имеет три уходящих групп и одну функциональную группу, обеспечивает мост ставкуween неорганические и органические поверхности молекулы зонда. Основная функциональность амин реагирует с эфирами количественно NHS формировать устойчивые связи амида. В этом случае мы используем молекуле биотина зонд которого валериановая боковой цепи была изменена с группой NHS эфира. В действительности, любой пробной молекулы, к которым группа NHS эфир может быть добавлен к поверхности, используя следующие протоколы. Кроме того, эти протоколы носят общий характер, и может быть использован для functionalize любой поверхности кремния устройства с биотином.

Основная проблема с этими протоколами на самом деле не в самой химии, а в обработке кремния микросферы. Пожалуйста, обратите внимание, что на протяжении протоколов, микросферы должны быть обработаны grapsing стебли слегка заостренными пинцетом. Это держит пинцетом и от себя микросферы, и позволяет легко осуществлять перевозки между шагами. Многие шаги в протоколе ниже, специально предназначенные для решения этого фактаили.

2. Изготовление микросфер

1. Построить жилье для хранения микросферы.
   1. Используя нож Exacto, нарезать ¼ в толстый кусок картона в 1 х 1 в квадрат, это лента на обычного размера стекло, и приложите 1 в разделе скотч, с конца встречи, чтобы сформировать рулон , на картоне.
   2. Это создает платформу, на которой микросфер может быть повышен и изолированы от окружающей среды, а также предотвращает повреждение их поверхности.
2. Используя ножницы, разрезать 3-дюймовый раздел оптического волокна с катушкой оптического волокна.
3. С помощью No-Nik волоконно-стриптизерши, лишить защитных полимерных покрытий из последних 0,5 дюйма конца отрезанный кусок волокна, оставив только ядро ​​кремния. Очистить поверхность от любых оставшихся полимера с Kimwipe смоченной метанола, осторожно вытирая волокно с Kimwipe.
4. С помощью голого волокна нож, обрезать зачищенный конец так-йна лишь около 1 миллиметра лишен волокно остается на конце волокна.
5. Поместите лишен конце оптического волокна на путь СО _{2-лазера,} заботясь, чтобы вертикального выравнивания волокон, что ее лишили концом вниз.
6. Включите СО _{2-лазера,} и направить ее к поверхности раздела конце оптического волокна. Лазер будет таять лишен конце волокна в сфере использования примерно 3,5% мощности в 2 секунды.
7. С помощью пинцета аккуратно понять основы (без оголенную часть оптического волокна) микросфер. Прикрепите стволовых ленты рулона на микросфер жилья. Стекло может быть самой хранятся в чашке Петри. Это позволяет для безопасного хранения микросфер.

3. Заполнение поверхности с гидроксильных групп

1. Использование пираньи решение:
   1. В 60 мл полипропилен флакон с крышкой откидной, подготовить решение пираньи (70:30 по объему дымящей H 4: H ₂ O ₂ (30% по массе)) с добавлением 5 мл перекиси водорода во флакон, затем на 11,6 мл дымящей серной кислоты. ВНИМАНИЕ: носить кислотостойкие перчатки.
   2. Передача стекло, держа по крайней мере 1 микросфер, на флаконе. Микросферы должны быть в контакте с жидкостью, а жидкость не должны касаться картона. Регулировка громкости решения, если это необходимо.
   3. Аккуратно снимите стекло из флакона, и вставить его в другой пластиковый флакон, содержащий DDI H ₂ O. Пусть сидят образцы в раствор в течение 5 минут.
   4. Аккуратно снимите стекло из флакона, и поместить его духовке при температуре 80 ° С в течение 10 минут, чтобы высушить поверхность.
2. Использование лечения кислородной плазмы:
   1. Передача стекло содержащих хотя бы один микросфер в камеру кислородной плазмы.
   2. Установить давление кислорода 200 мторр и мощности до 120 Вт Выставьте образца в кислородной плазме на 2 милиnutes.
   3. Снимите стекло из плазменной камеры.

4. Установка силана связующие вещества на поверхность

1. Положите стекло, содержащие хотя бы один микросфер, в вакуум-эксикаторе в вытяжном шкафу.
2. Кроме того, в вытяжной шкаф, откройте бутылку силана агентом соединения (в данном случае, aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) был использован), и поместите открыл бутылку в эксикаторе.
3. Замените крышку на вакуум-эксикаторе и прикрепите розетку порт аспиратор или линии дома вакууме.
4. Включите вакуумный дома или уровня воды, и эвакуировать вакуумном эксикаторе. После того, как вакуум образуется уплотнение между крышкой и основанием, начать отсчет времени реакции. Это позволит внести силана средство связи на поверхности в виде тонкой пленки.
5. Через 15 минут, выключить вакуум, и медленно открыть порт, чтобы воздух в эксикаторе. Для этого связующего, 15 минут достаточно, чтобы сформировать unifoгт монослоя на поверхности. Для других средств связи, время, возможно, придется скорректировать.

5. Установка биотин на поверхность

1. Примерно за час до присоединения биотин, подготовить 10 мМ раствор N-hydroxylsuccinimide биотин (NHS-биотин) в безводного диметилсульфоксида (ДМСО) в 60 мл флаконе полипропилена с крышкой на шарнирах.
   1. Если NHS-биотин хранился холодным, чтобы она могла уравновешивать до комнатной температуры массирование его.
   2. Разрушать ультразвуком решение в течение 1 часа, чтобы полностью растворить NHS-биотин порошка в растворителе.
2. Передача стекло содержащие микросферы в другой пластиковый флакон с микросферами на дне, и стебли в верхней части флакона.
3. Передача с помощью пластиковой пипетки соответствующего объема NHS-биотин решение вниз стороне флакона, за стекло (так, решение не касается микросфер, как это добавляется к флаконе).дд достаточно решением для покрытия поверхности микросфер.
4. Установите флаконы теперь содержащие микросферы и NHS-биотин в растворе ДМСО на качалке инкубатор (наклон лотка) в течение 30 минут при комнатной температуре, со скоростью и углом наклона в 5 мин и 5 градусов соответственно.
5. Аккуратно снимите стекло из флакона, и осторожно вставьте ее в другой флакон заполнен DDI H ₂ O. Поместите флакон от наклона лотка в течение 10 минут с той же скоростью и углом наклона, как раньше. Повторите этот шаг дважды с пресной водой, каждый раз. Это помогает удалить излишки ДМСО с поверхности, и удаляет любые физически адсорбированной биотин, что на самом деле не привитых к поверхности.
6. Снимите стекло из флакона, и поместить его в духовке при температуре 80 ° С в течение 10 минут, или пока все капли воды удаляются с поверхности.

6. Флуоресцентная маркировка амин завершающим кремния

1. Для обозначения аминогруппами настоящее время после treatmЛОР с APTMS, подготовить FITC решение в затемненной комнате, растворив 1 мг FITC в 1 мл безводного ДМСО.
2. Разбавьте раствор в 6,1 добавлением 50 мкл FITC раствора на 1 мл 0,1 М буфере бикарбоната натрия.
3. Поместите раствор в 60 мл флаконе полипропилена с откидной крышкой, и аккуратно сдвиньте амин завершающим микросфер, который находится снова на стекло, на флаконе.
4. Поместите флакон в ледяной ванне, и пусть образца реагирует с FITC решение в течение как минимум 4 часа в темноте.
5. Удалите излишки флуорофора через два, 10 минут полоскания микросфер натрия карбонатного буфера. Как и прежде, заполнить 60 мл флакон с полипропиленовой крышкой с откидной буфера, и осторожно вставьте стекло в раствор, следя за тем, что решение распространяется только на микросфер, а не картонный корпус. Крышка флакона с алюминиевой фольгой и поместить во флакон на наклонном лотке установлен на 5 градусов и 5 мин, как раньше.
6. Аккуратно снимите стекло из флакона, и осторожно вставьте ее в другой флакон заполнен DDI H ₂ O и покрыты алюминиевой фольгой. Поместите флакон от наклона лотка в течение 10 минут с той же скоростью и углом наклона, как раньше. Повторите этот шаг дважды с пресной водой, каждый раз. Это помогает удалить излишки краски с поверхностью.
7. Аккуратно снимите стекло из флакона, а в сухом сушильном шкафу при температуре 80 ° С за 10 минут до съемки.

7. Флуоресцентная маркировка биотин завершающим кремния

1. Подготовьте 10 мкг / мл раствора Техас-красный авидин в фосфатном буферном растворе.
2. Добавить решение 60 мл флакон полипропилена с откидной крышкой, и аккуратно сдвиньте стекло содержащие биотин завершающим микросфер в раствор так, что микросферы просто покрыта раствором.
3. Реакция в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
4. Удалите излишки флуорофора через два, 10 минут промойтес микросфер в PBS буфера.
   1. Как и прежде, заполнить 60 мл флакон с полипропиленовой крышкой с откидной буфера, и осторожно вставьте стекло в раствор, следя за тем, что решение распространяется только на микросфер, а не картонный корпус.
   2. Крышка флакона с алюминиевой фольгой и поместить во флакон на наклонном лотке установлен на 5 градусов и 5 мин, как раньше.
5. Аккуратно снимите стекло из флакона, и осторожно вставьте ее в другой флакон заполнен DDI H ₂ O и покрыты алюминиевой фольгой. Поместите флакон от наклона лотка в течение 10 минут с той же скоростью и углом наклона, как раньше. Повторите этот шаг дважды с пресной водой, каждый раз. Это помогает удалить излишки краски с поверхностью.
6. Аккуратно снимите стекло из флакона, а в сухом сушильном шкафу при температуре 80 ° С в течение 10 минут до съемки.

8. Представитель Результаты

Правильно функциональными микросферс могут быть идентифицированы с помощью оптической и флуоресцентной микроскопии. Если поверхность функционализации сделано правильно, это должно привести к равномерно плотные покрытия биотин молекул на поверхности, а поверхность должна оставаться дефектов и загрязнений без после функционализации с целью поддержания их высокой чувствительности при обнаружении экспериментов. Оптическая микроскопия может быть использована для исследования последнего, а флуоресцентной микроскопии можно исследовать качество и однородность поверхности покрытия. На рисунке 2 мы показываем примеры правильного функциональными микросферы. Эти снимки показывают, что нет повреждений поверхности или загрязнения в результате функционализации (рис. 2а), а микросферы показывают единой, последовательной покрытие или аминогрупп (рис. 2б), или биотин группы (рис. 2) на поверхности .

Если микросферы не были функциональными правильно, оптических изображений микросфер шбуду выставлять поверхностного загрязнения, слипания или не равномерное покрытие, и очевидные дефекты поверхности, как поверхности трещины (рис. 3). Здесь мы видим типичный пример поверхностного загрязнения в результате слипания реагентов на поверхности.

Рисунок 1. 3-х ступенчатая схема реакции для крепления датчика молекул на поверхности кремния микросферы. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2. Silica микросферы. а) Оптические микрофотографии кремния микросферы заполняются гидроксильных групп с помощью воздействия кислородной плазмы, б) Флуоресцентные микрофотографии кремния микросферы заполняются первичные амины и помечены FITC краситель, в) Флуоресцентные микрофотографии кремния мильcrosphere заполняется биотин и помечены Texas Red-авидин сопряжены. Печатается с разрешения Soteropulos, CE, Хант, HK & Armani, А. М. Определение обязательных кинетики использованием шепот микрорезонаторах галерея режиме. Appl. Phys. Lett. 99, 103703-103703 (2011). Copyright 2011, Американский институт физики ^17.

Рисунок 3. Оптические микрофотографии неправильно функциональную сферу. Здесь вы можете увидеть пыль в правом верхнем углу поверхности, а также загрязнение расширения с поверхности. Кроме того, справа от оптического микросфер показывает небольшую дерн на поверхности.

Discussion

Как указано в протоколах, мы создали платформу жилье с помощью которого можно транспортировать кремния микросферы их стебли всей функционализации процесса. Это жилье платформа была создана в качестве решения для поверхностного загрязнения и повреждения, которые привели из микросфер соприкосновении со стенками из различных контейнеров, используемых в процессе функционализации. Мы поняли, что основная трудность возникла с постоянно присоединения и отсоединения отдельных микросфер для различных контейнеров в функционализации процесса. Трудно было избежать чистки микросфер от объекта при перемещении каждый в отдельности с помощью пинцета, держа на стеблях. К стабилизации положения каждого микросфер на стекле, мы могли просто переместить ряд микросфер и из разных контейнеров с помощью обработки стекло, а не ствола микросфер. Таким образом, мы смогли functionalize многие из этих разработчикальдов в то же время, и мы исключили загрязнения и повреждения поверхности, вызванные неправильным обращением, в результате чего до 90% успеха создания повреждений, функциональными микросферы.

Как указано в протоколах, мы исследовали два метода, по которому гидроксилировать кремния микросферы. В то время как пираньи решение обычно используется для этого, это может занять много времени и требует мокрой химии. При работе с микросферами, мы отметили превосходство гидроксилирования через кислород плазменной обработки. Лечение кислородом плазмы не требует контакта с жидкостью решения, не сушка, а не обработки кремния микросферы. Кроме того, это намного быстрее, процесс заполнения поверхности гидроксильных групп. Тем не менее, мы признаем, что не каждая исследовательская группа будет иметь доступ к кислородным оборудованием плазмы, и поэтому, возможно, придется использовать пираньи решение сформировать необходимую гидроксильную функциональность. Использование либо приведет к образованию гидроксильных группповерхности.

Предотвращение загрязнения поверхности при функционализации является серьезной проблемой, но она может быть сведена к минимуму тщательным соблюдением протокола. Наиболее вероятными причинами загрязнения являются бедными обращения при функционализации, а также неправильной или не тщательная промывка поверхности после каждой из стадий реакции. Это особенно верно во время первой стадии реакции, при которой поверхность заполняется гидроксильных групп. Если пираний решение выбрано для этого метода, необходимо позаботиться, чтобы полностью удалить серную кислоту с поверхности и тщательно высушите микросфер, так как поверхность в настоящее время очень гидрофильным, и вода из полосканий цепляется за поверхность. Если серная кислота остается на поверхности, микросферы становятся «липкими» и пыль из лабораторных условиях собирает на поверхности с большей готовностью. Кроме того, капли воды на поверхности вызывает силана средство связи собираться в районе Ватэ капель, образуя полимерную шар кремния, который рассматривается как наносить удар в люминесцентной микроскопии. Если поверхность слипания имеет место, предотвращает микросфер от использования в обнаружении экспериментов, так как большое падение чувствительности устройства. Как правило, при лечении кислородной плазмы используется поверхности слипания, а также загрязнения, сведены к минимуму. Однако, не каждая лаборатория имеет доступ к этому оборудованию, поэтому использование пираньи решение может быть необходимостью.

Наконец, мы нашли, нужно было разрушать ультразвуком NHS-биотин раствор перед использованием, чтобы полностью растворить NHS-биотин в ДМСО. Когда этот шаг был пропущен, NHS-биотин сдаст на поверхности в больших скоплений с помощью физической адсорбции, а не ковалентно привязки к поверхности. Эти большие скопления очень трудно удалить в течение этапов промывки, но могут быть предотвращены путем надлежащего распространения на начальном роспуска. Один час, как правило, достаточно для этой цели;Однако, если эти процедуры распространяются на другие молекулы зонда модифицированные группы NHS эфир, мы рекомендуем оценить решение с помощью динамического рассеяния света для обеспечения полного растворения.

В протоколах подробно здесь представляют собой шаг вперед в переводе плоской поверхности кремнезема химии для трехмерных устройств, где качество покрытия поверхности и поверхности устройства одинаково важны для конечного использования устройства. Когда эти протоколы используются, полностью функциональными микросферы равномерно показала плотный охват пробной молекулы, без загрязнения или слипания на поверхности. Это равномерное покрытие поверхности обеспечивает поддержание высокой чувствительности, когда эти устройства используются в обнаружении экспериментов. Использование средств связи силана как мост между неорганической подложки и биологической молекулы зонда проста и понятна, и может быть использован, в частности, хорошо понимали (и очень сommon) NHS эфир химию, для заполнения поверхности оптического биосенсора с зондом молекул различных типов.