Summary
상피 세포가 3 차원 세포 골재 형성의 결과로 생리적 조건에서 성장할 수있는 회전 세포 배양 시스템이 설명되어 있습니다. 집계는 디스플레이를 생성
Abstract
셀 및 신체 경험들이 건축에 영향을 미치는 환경 조건, 세포 통신, 그리고 전반적인 기능의 조직. 체외 세포 배양 모델에 정확하게 흥미 조직을 모방하기 위해서는 문화의 성장 환경은 고려해야 할 중요한 측면이다. 일반적으로 사용되는 기존의 세포 배양 시스템은 평면 (2 차원) 2 차원 스며들지 않는 표면에 상피 세포를 증식. 많이는 기존의 세포 배양 시스템에서 배운되었지만, 많은 연구 결과는 잠재적으로 생리학 관련 microenvironment의 부족의 결과로, 인간 임상 실험이나 조직 explants에서 재현할 수 없습니다.
여기서는 혁신적인 회전 벽 혈관 (RWV) 생물 반응기 기술을 사용하여, 2 차원 세포 배양의 문화 조건 경계의 많은를 극복하는 문화 시스템을 설명합니다. 우리와 다른 organotypic RWV 파생 모델 structur을 요점을 되풀이 수있는 것으로 나타났습니다전자, 기능과 마찬가지로 인간 explant 조직 1-6 외부 자극에 본격적인 인간의 반응. RWV의 생물 반응기는 낮은 생리 유체 전단 조건 하에서 상피 세포의 성장을 허용 서스펜션 문화 시스템입니다. bioreactors는 두 가지 형식으로, 높은 측면 회전 용기 (하브) 또는 그들의 폭기 소스에 따라 다릅니다하는 천천히 돌려 측면 혈관 (STLV)로 왔습니다. 상피 세포는 다공성, 콜라겐 코팅 microcarrier 비즈 (그림 1A)와 함께 선택의 생물 반응기에 추가됩니다. 세포 생물 반응기에서 일정한 자유 낙하 (그림 1B) 동안 성장을 발판으로 구슬을 활용. 생물 반응기에서 제공하는 microenvironment는 세포가 종종 표준 2 차원 배양 조건 (그림 1D)에서 관찰되지 생체내 같은 특성으로 표시 (3-D) 입체 집계를 형성 할 수 있습니다. 이러한 특성은 꽉 분기점, muc 포함생체내 단백질 지방화 및 추가 상피 세포 타입의 특정 속성의 회사 생산, 기저 / 혀끝의 방향.
완전히 차별화된 3 차원 집계에 상피 세포 단일층의 진행은 셀 타입 1, 7-13에 따라 다릅니다. 생물 반응기에서주기적인 샘플링은 상피 집계 형성, 세포 분화 마커와 생존 (그림 1D)의 모니터링을 허용합니다. 일단 세포 분화 및 골재 형성이 설정되고, 세포가 생물 반응기에서 수확하고, 유사한 assays는 2-D 세포에서 수행된 몇 가지 고려 사항 (그림 1E-G)와 3 차원 집계에 적용할 수 있습니다. 이 작품에서 우리는 어떻게 문화의 RWV의 생물 반응기 시스템의 3 차원 상피 세포 집계하고 3 차원 합산으로 실행될 수있는 잠재적인 assays와 분석 다양한 있습니다. 세부 단계를 설명 이러한 분석을 포함하지만, M / 구조에 국한되지 않습니다orphological 분석 (공촛점, 검사 및 전송 전자 현미경), 시토킨 / 케모카인 분비 및 세포 신호 전달 (cytometric 비드 배열과 서양 얼룩 분석), 유전자 발현 분석 (실시간 PCR), 마약 / toxicological 분석과 호스트 병원체 상호 작용. 이러한 assays의 활용도는 metabolomics, transcriptomics, proteomics 및 기타 어레이 기반 응용 프로그램을 더욱 깊이와 광대한 연구를위한 토대를 설정합니다. 우리의 목표는 다양한 과학적인 이해 관계와 연구자에 의해 사용될 수있는 손쉬운하고 안정적인 시스템에서, 생체내 조직의 인간을 요점을 되풀이하다 organotypic 3 차원 모델을 생산하는 culturing 인간 상피 세포가 아닌 종래의 방법을 제시하는 것입니다.
Protocol
모든 단계 층류 후드의 BSL-2 조건 하에서 수행되어야합니다.
1. STLV 생물 반응기 준비
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 STLV 생물 반응기를 구성하고 생물 반응기의 불임을 보장하기 위해 해독 프로토콜을 수행합니다. luer 대문자로 열려있는 포트를 커버와 24 H를위한 95 %의 에탄올과 STLV 채우십시오.
- 에탄올을 제거와 24 H를위한 멸균 증류수로 STLV 채우십시오.
- 전용 멸균 증류수로 1.2 단계를 반복합니다.
- 공급 업체에서 제공하는 도구를 살균 주머니에서 20 분 동안 110 ° C에서 모든 나사, 모자, 센터 플러그인 STLV에서, 그리고 압력솥을 푸세요.
- STLV이 냉각되면, 나사를 조여 및 불임과 완전한 해독을 보장하기위한 조치 1.1-1.4를 반복합니다.
- 각 포트에 대한 사전 소독 단방향 stopcocks에 STLV와 나사를 냉각의 나사를 조이십시오.
- 수직 손잡이를 배치한를 엽니다 꼭지.
- 다시 래퍼의 불임을 유지하기 위해 10 ML 5 ML luer 잠금 주사기 및 재 슬리브 plungers에서 plungers를 제거합니다. stopcocks쪽으로 주사기 (luer 잠금 팁 주사기는이 단계에 필요한)을 보자.
- Dulbecco의 추가 인산 버퍼 식염수 (DPBS) 10 ML의 주사기에 STLV가 가득하며 5 ML의 주사기를 채우기 위해 시작하기 전까지.
- 각 주사기로 멸균 plungers를 교체하고 주사기 plungers 운전 사이에 번갈아에 의해 생물 반응기에서 발생하는 잔류 기포를 제거합니다.
- 모든 거품을 제거 후 생물 반응기에 연결된 주사기를 남겨주세요. 닫기 stopcocks하고 회전 수직 플랫폼 STLV을 첨부하고 누출을 모니터링할 24 H의 최소 회전.
2. Microcarrier 비즈 준비
- STLV (1.4)와 동일 조건 하에서 50 ML 원뿔 튜브 및 압력솥에서 ~ 250 MG cytodex microcarrier 비즈 15 ML DPBS를 추가합니다.
- 냉각 후, DPBS를 제거 epitheli를 성장하는 데 사용되는 매체를 추가하십시오알은 관심 세포, 그리고 소용돌이 관 구슬을 resuspend합니다.
- 미디어 두 개 더 시간과 단계를 씻어 반복합니다. 최종 세척은 구슬 15 ML 성장 미디어를 추가한 후.
3. STLV 생물 반응기로 상피 세포와 비즈을 퍼뜨리고
- 당신 ≥ 1x10 7 세포를 얻을 때까지 조직 문화 flasks에 monolayers 같은 관심 상피 세포 성장. 플라스크 (예 trypinsization, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에서 세포를 제거 세포 농도를 확립하기 위해 세포를 세고, 그리고 trypan 파랑 제외 염색법 1 세포의 생존을 결정합니다.
- 준비된 구슬 (2.3 참조)이있는 원뿔 튜브로 의도의 상피 세포 유형 (그림 1A)에 따라 세포의 원하는 농도 (2x10 5-1x10 7 상피 세포) 2, 8을 추가합니다. 모든 세포는 원뿔 튜브를 rinsing에 의해 전송되는 확인하십시오.
- STLV에서 DPBS과 주사기를 제거합니다.
- 중앙 포트에서 플러그를 제거하고 상피 C를 추가내말이 맞지 / 10 ML serological 피펫을 사용하여 STLV에 구슬 현탁액. 모든 셀을 / 구슬이 STLV로 전송되도록 서 포트 플러그를 대체하는 원뿔 튜브를 씻어.
- 불임을 유지하기 위해 다시 래퍼에서 5와 10 ML의 주사기와 다시 슬리브 plungers에서 plungers를 제거합니다. 오픈 stopcocks와 포트로 주사기를 보자. plungers, 그리고 가까운 stopcocks를 대체 미디어로 STLV를 채우십시오.
- 없이 회전과 30 분 동안 37 ° C 배양기에서 새로 놓는 STLV를 놓습니다.
- 오픈 stopcocks는 plungers를 사용하여 거품을 제거한 다음 닫기를 stopcocks.
- 20 RPM (그림 1B)에서 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기 humidified 회전에 STLV를 놓습니다. 문화는 샘플링, 변화하는 미디어, 혹은 수확을 합산합니다 (다음 절 참조)를 제외하고 24헥타르 일 연속적으로 회전해야합니다.
4. 문화 Culturing, 샘플링 및 사진 설명서
- BI의 culturing 전지의 초기 96-120 H 후틸팅 STLV 및 세포 / 구슬이 정착함으로써 oreactor, 변경 미디어. , 주사기를 제거 모두 stopcocks을 열고, 사이드 포트 (그림 1C)에서 미디어의 ~ 75 % 내려 부어. 미디어의 세포 신진 대사를 바탕으로, 미디어 초기 시딩 및 96-120 H 문화 시대 이후 매일 또는 격일로 변경합니다.
- 5 plungers 10 ML 주사기 공극 나사로 고정하고 위에 설명된대로 refeeding 프로토콜 (1.7-1.11)에 따라 다음 나사 플랫폼을 회전에 STLV을 다시 자리에 마감했다.
- 매 5~7일 신중이 1.5 ML 튜브로 중앙 포트에서 집계 소량 (~ 200 μL)를 제거하여 STLV에 퍼뜨리고 후 집계의 성장과 생존을 모니터링합니다. 집계 전단을 피하기 위해 모든 집계 전송을 위해 지점에서 ~ 2 센티미터 잘라서 소독되어 1000 μL 피펫 팁을 사용합니다.
- , 가운데 플러그, 새로운 주사기와 교류를 바꾸기 위에서 설명한 STLV (1.7-1.11)에 새로운 미디어를 추가하고 STLV을 다시에 배치회전 배양기 (3.8 참조).
- 세포 생존을 모니터하는 단계 4.3에서 aliquoted 두 1.5 ML 튜브 집계 중 하나를 사용하고, 상피 세포 조직 문화 flasks (예 trypsinization)에서 제거하는 것과 같은 방식으로 구슬에서 세포를 제거합니다. 1 더럽히는 것 trypan 파랑 제외하여 생존을 모니터링합니다.
- 이미징 세포 집계를 보려면 두 번째 1.5 ML 집계 나누어지는 및 컷 - 오프 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 작은 배양 접시에 전송로 매체의 0.5-1 ML을 추가합니다. 거꾸로 가벼운 현미경을 사용하여 이미지 집계 (그림 1D).
5. 집계를 전송하고 착취
- 일부 상피 세포 모델의 경우는 문화 폭기 2를 높이기 위해 일회용 하브로 집계를 전송할 필요가 있습니다. 약 사전 분석을 위해 집계를 수확 한 주, STLV에서 주사기 및 stopcocks을 제거하고 사이드 포트에서 미디어의 ~ 50 % 할인 붓는다.
- 엎드려서STLV의 중심 플러그를 ove 조심스럽게 중앙 포트 (그림 1E)에서 50 ML 원뿔 튜브에 모든 내용을 붓는다. 5 ML 미디어와 STLV을 차례로 두 번 씻어 및 집계의 나머지 린스 결합.
- 5.2에 설명된대로 집계 전송을 계속하지만, 50 ML 원뿔 튜브에서 하브로 전송 집계.
- 등 ~ 1 주 일 또는 STLV에서 하브에서 조심스럽게 수확을 합산은 (세포 유형에 따라) (5.2) 위에서 수행되었다. 골재 수확에 따라 잠재적인 분석 형식 assays 및 분석 내용은 아래를 참조하십시오.
6. 집계에 따른 잠재적인 분석, 응용 프로그램 및 Assays
- 다양한 실험적 형식 퍼뜨리고 집계가. 1.5 ML 관, 24 잘 플레이트 또는 소독을 절단 1,000 μL 피펫 팁 (그림 1 층)을 사용하여 96도 접시에 50 ML 원뿔 튜브에서 집계 중 원하는 금액을 전송합니다.
- 세정 prepar분석을 위해 집계를 접근한. 집계 정산을하면 미디어를 제거합니다. 튜브의 중심에 직접 DPBS 하는걸거나 잘하므로 모든 집계가까지 흔들 수 있습니다. 일단 집계가 아래로 정착, DPBS를 제거하고 필요에 따라 오랜 시간 동안 반복한다.
- 오프 사이트 실험 및 분석을위한 선적을 합산 있습니다. 50 ML 튜브로 집계 중 원하는 금액을 추가하고 6.2에서와 같이 집계를 씻는다. 완벽하게 누수를 방지하기 위해 캡 주위 미디어, 캡, 그리고 parafilm으로 50 ML 튜브를 입력하십시오. 안전하게 주위 온도에서 하룻밤 사이에 원하는 위치로 합산을 보내주십시오.
- 전자 현미경에 대한 고정 합산합니다 (그림 2). 스캔, 전송 또는 immuno-전자 현미경은 1.5 ML 관에 150-300 μL 집계를 전송하고 DPBS (6.2)로 집계에게 3 번 세척하여 실시 할 수 있습니다. 원하는 잠복기를위한 애플 리케이션 전용 (SEM, TEM, immuno-EM 등) 전자 현미경 정착액 200 μL를 추가합니다. 제거 aggregat 씻어, 수정초밖에이 DPBS와 시간 및 진행은 Hjelm 외에 제시된. 2010 검사 및 전송 전자 현미경 2.
- Immunofluorescence 현미경 이미징 (그림 3). 양도 ~ 1.5 ML 튜브 및 세척을 합산 (6.2) 100 μL을 합산합니다. 1.5 ML 튜브를 제외하고 monolayers와 같은 유사한 조건 하에서 수정하고 항체가있는 라벨을 합산합니다. , 마운트 현미경 슬라이드에 장착 미디어 1 방울을 배치하려면 컷 - 오프 집계 1000 μL 피펫 팁, 장소 coverslip, 매니큐어와 인감 coverslip, 그리고 하룻밤 건조 슬라이드 2 장착 미디어 위에 표시된 집계를 전송합니다.
- 세포 생존 / MTT 분석을 (그림 4)를 사용하여 확산을 측정. 24 잘 플레이트로 전송 집계가와 625 μL 페놀 레드 무료 미디어와 미디어를 교체하십시오. 각도에 5 밀리그램 / ML Thiazolyl 블루 Tetrazolium 브로마이드 (MTT)의 62.5 μL를 추가 37 4 H 동안 품어 ° C. 100 MG / ML SDS-0.01의 625 μL를 추가하십시오M 각각 잘으로 HCL하고 밤새 품어. 570 nm의 흡광도에서 읽기 및 방정식을 사용하여 % 세포 생존을 얻을 :
- 독성 연구. 24 잘 플레이트로 집계 전송과 초기 세포 생존 / 농도에 대한 ≥이 우물에 trypan 파랑 제외를 수행합니다. 우물을 복제하기 위해 농도를 이르는에서 테스트 화합물을 추가합니다. 세포 생존 능력의 경우 (그림 5A), 집계를 씻어 및 치료 후 trypan 파랑 제외를 수행합니다. TC 50 (그림 5B), 시간이 지남에 따라 각 농도에 대해 중복 우물의 세포 생존 능력을 가지고 독성 농도 50 % 2, 15을 결정하는 리드 Muench 메서드를 사용합니다.
- Cytometric 비드 배열 (CBA) 또는 엘리사. 셀룰러 supernatants는 diagrammed 어떤 실험적인 형식으로 세포를 퍼뜨리고 후 촬영하실 수 있습니다. 로 세포 성장과 마찬가지로 씨앗을 품고 집계를 자극monolayers은 엘리사 또는 CBA (그림 6)에 의한 분석을 위해 -80 ° C에서 supernatants (≥ 120 μL), 그리고 저장소를 수집합니다.
- RNA 분석. 1.5 ML 관과 DPBS로 세척을 합산로 집계의 ≥ 500 μL를 전송합니다. 20 게이지 바늘을 사용하여 lysate의 균질과 동물의 세포를 위해 Qiagen RNAeasy 키트 및 프로토콜을 사용하여 추출을 계속합니다. 구슬은 사전에 뜨는 전송로 튜브의 하단에 정착, 그리고 스핀 열 (구슬은 낮은 RNA 수율 결과 열 멤브레인을 방해할 것이다) (그림 7)에 빈 구슬을 전송하지 마세요 들어오게해야합니다.
- 단백질 분석. 1.5 ML 튜브 또는 더 큰 실험적인 형식을 사용 monolayers과 같은 방법을 아래에 수확을 합산합니다. 그러나 집계의 용해 후, 비즈는 단백질 겔이나 단백질 분석의 다른 형태 (그림 8)를 실행하기 전에 별도의 튜브로 lysate을 해결하고 전송할 수 있습니다.
- 감염연구. 원하는 실험적인 형식으로 종자 집계. 휴대폰 번호를 열거하고 세포 생존을 계량하는 구슬의 세포 trypsinizing 위해 최소한 두 우물 / 샘플을 사용합니다. monolayers (그림 9)로 성장 세포를 수행할로 감염 선택한 다수에 관심있는 병원균과 집계를 감염. 워시 단계는 6.2에서와 같이 수행해야합니다.
- 유동세포계측법 : 50 ML 튜브, 세차 합산 (6.2), 37에서 5-10 분 동안 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가 ° C.의 종자 집계 세포에 5-10 ML 미디어를 추가하고 셀 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다. 추운 차단 솔루션에서 폴리 프로필렌 튜브 및 세척 세포로 나누어지는 1x10 6 전지 (1 % PBS에서 FBS). 항체 및 제조 업체에 따라 부화와 세포를 Resuspend. 분석 (그림 10)에 튜브를 필터링하기 위해 PBS에 resuspend 원심 분리하여 세포, 그리고 전송 세포를 씻으십시오.
7. 대표 결과
의 예STLV의 생물 반응기 시스템 재배 차별화된 인간 상피 집계는 그림 2에서 볼 수 있습니다. SEM 및 TEM 이미지는 microridges, invaginations, 세포내 분비의 vesicles, 그리고 혀끝의 표면의 microvilli를 볼 수 있습니다 39일 동안 STLV 재배 인간의 질 세포에서 수집하고 있습니다. 생물 반응기에서 자란 상피 세포의 생체내 같은 특성에의 추가 행동은 mucin (MUC1)를 표현하는 3 차원 질 세포 공촛점 immunofluorescence 현미경 이미지 (그림 3)과 상피 세포에 대한 특정 마커 (ESA) 및 단말 차별화로 볼 수 있습니다 (Involucrin, 인보이스).
과 같이 3 차원 집계은 그들보다 더 생리학 관련 phenotypes 또한 화합물의 독성을 평가하기위한 훌륭한 플랫폼 역할을하지만, 조직과 유사한 ultrastructural 기능을 표시합니다. MTT 분석, 세포 생존, 대사 또는 prolifera를 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 분석기는 다양한 화학 물질 및 화합물 (그림 4)에 독성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 트리톤 X-100, 세포 세포막을 파괴하는 합성 세제는 MTT 분석을 확인을위한 긍정적인 제어로 사용되었다. 시험 화합물과 치료에 따라 독성을 측정하기위한 추가적인 방법은 trypan 파랑 제외 (그림 5)입니다. 논옥시놀-9 (N-9)과 치료에 이어 질 집계는 자궁 explant 모델의 그것과 유사한 독성 반응을 보여주지만, 다른 프로필 monolayers 2, 16으로 비교했다.
생체내의 조직에 기능과 유사하게 신호 생물 반응기에서 생산된 상피 세포의 능력을, 보여주는 추가 연구는 그림 6에서 볼 수 있습니다. 수신자 같은 수용체 (TLR)에 의해 인정되는 미생물에서 유래 분자로 자극시 집계는 응답 및 IL-6 1을 포함한 프로 염증성 크린 시토킨을 분비.progesterone 수용체 (PR), 호르몬 자극에 반응 수용체의 표현도 모두 RNA와 단백질 수준 (그림 7과 그림 8을 각각)에서 질 세포에서 볼 수 있습니다. 3 차원 집계는 병원체와 호르몬 분자에 대응하는 기능을 가지고, 또한 기능적으로 헤르페스 바이러스 2 형 (HSV-2) 감염을 단순 지원할 수 없습니다. HSV-2 감염 3 차원 질 합산합니다 (그림 9)의 공촛점 현미경 이미지는 감염을 보여줍니다. 병렬 2-D 질 상피 세포 배양은 HSV-2 감염에 의한 심한 세포 파괴의 결과로 표시되지 않습니다. RWV-파생된 3 차원 집계는 각각 세포 성장 곡선과 상패를 assays를 통해 8, 9 세균과 바이러스 복제를 계량하는 데 사용되었습니다. 마지막으로, 집계 내에서 개별 세포의 물리적, 기능적 특성도 유동세포계측법에 의해 계량하실 수 있습니다. examp 위해르, 우리는 개인적인 질 세포 (그림 10)에서 MUC1 표면 표현을 측정하는 유동세포계측법 분석을 고용. 질 3 차원 집계가 monolayers (67.2 %)에 비해 MUC1의 낮은 비율 (27.7 %)를 표명했다. monolayers에 비해 3 차원 집계 표면의 MUC1의 낮은 비율 질 넓이 17, 18에서 관찰로서 세포에서 분비되는 MUC1의 대부분의 결과가 될 수도 있습니다.
1 그림. RWV 파생 집계를 사용 culturing RWV에서 인간 상피 세포 및 잠재적인 애플 리케이션을위한 설계도.)은 상피 세포가 처음 조직 배양 플라스크에 monolayers으로 재배하고 있습니다. 일단 합류, 전지 플라스크에서 제거하고 STLV의 생물 반응기에서의 microcarrier 비즈와 결합됩니다. 스케일 바 :. 80 μm의 B) STLV은 낮은 F의 일정한 자유 낙하 환경을 만드는 플랫폼에 회전세포 STLV에, 96 H 후)이를 볼 휴대 집계. C를 형성 구슬에 미디어를 장착하고 성장할 수 있도록 LUID 전단은 세포 신진 대사에 대한 수용하기 위해 변경해야합니다. 미디어가 사이드 포트 부어 있으며, 신선한 미디어가 첨부된 10 ML의 주사기 (플런저 제거)를 통해 교체하고, 주사기 plungers 교체 및 압출 성형의 거품으로 사용됩니다. D)가 ~ 5 일 후에 (D) 집계가 형성되기 시작 . 집계는 칠일마다 샘플링하고 완료되면 골재 형성과 세포의 분화가 발생했습니다 그들의 발달적 진보 (3-D 인체 상피 질 세포의 20x 배율). E)을 모니터링하는 가벼운 현미경으로 몇 군데있다 집계가와 생물 반응기에서 수확되는 pote 50 ML 원뿔 튜브로 전송. F)의 집계는 1.5 ML 관이나 실험적인 분석과 assays을 수행하기 위해 다중 잘 플레이트 형식으로 놓는 수 있습니다. G가) 개요 집계를 수행할 수 ntial assays 및 분석합니다. 분석이 대표적인 목록은 모든 잠재적인 다운 스트림 애플 리케이션의 완전한 카탈로그하라고있는 게 아닙니다.
그림 2. 전자 현미경을 사용하여 3 차원 상피 세포의 형태학의 집계 및 구조 특성을 검사. (A) 전자 현미경 (SEM) 3 차원 인간 내피 질 세포 골재의 이미지를 스캔. 스케일 바 : 200 μm의 (100x), 100 μm의 (200x), 50 μm의 (500x). 화살표가 (B) 세포내 분비의 vesicles 및 microvilli 또는 (C) "세포질 프로세스"를 가리키고있는 3 차원 인간 내피 질 세포 골재의 전송 전자 현미경 (TEM) 이미지입니다. 스케일 바 : 2 μm의 (Hjelm 외에서 수정 2010.) 2.
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그림 3. 공촛점 immunofluorescence 현미경 3 차원 상피 세포 집계에 junctional 분화와 단백질 마커를 식별하는 데 사용됩니다. () mucin 항체 MUC1과 고정, 그리고 스테인드 32일 후 생물 반응기에서 수확한 인간 3 차원 질 세포, 특정 (B) 항체가 상피 세포, ESA, 또는 말기 차별 상피 세포를 인식 (C) 안티 Involucrin (인보이스) 항체. 집계는 간접적 알렉사 488 이차 항체 (녹색)으로 표시했다. 스케일 바 : 60 μm의 (Hjelm 외에서 수정 2010.) 2.
4 그림. MTT 분석은 세포 생존을 측정하는 데 사용됩니다. 인간 3 차원 질 집계는 24 잘 접시에 놓는 37에서 미디어 홀로 (치료) 또는 0.01 %, 0.1 % 또는 1.0 % 1 H 용 트리톤 X-100 세제로 대하 ° C. 따라와 g 치료, 미디어가 제거되었고 MTT 분석은 세포 생존을 측정하기 위하여 수행되었다. ** P <0.001를 나타냅니다; 한 꼬리 학생의 T-시험이 경과 컨트롤에 트리톤 X-100 처리 세포를 비교.
그림 5. 화면 화합물 독성에 3 차원 상피 세포 집계를 활용. () 논옥시놀-9 (N-9) 선량에 의존 생존 곡선 24 H 3 차원 인간의 질 상피 세포 모델 (빨간색 선 / 막대)의 사후 치료에 비해 동일한 셀 유형 합류 monolayers (검은 선 / 막대)로 성장. (B) N-9 TC () 1.5에서 H, 4 H, 8 H, 24 H 게시물 치료의 질 상피 세포 배양의 50 층. * P에게 <0.05를 나타냅니다; 한 꼬리 학생의 T-테스트 각 노출 시간에서 3 차원 세포에 monolayers을 비교. (Hjelm 외에서 수정하였습니다. 2010) 2.
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6 그림. 수신자 같은 수용체 (TLR) 작용제의 자극에 대한 반응으로 3 차원 상피 세포에 시토킨 생산의 분석. 세 차원 인간의 질 세포 FSL-1 (TLR2 / 6), PIC (TLR3), 신고 (TLR5)로 자극했다 , 24 H 및 분비의 크린 시토킨위한 CL097 (TLR7 / 8)은 cytometric 비드 배열에 의해 측정되었다. IL-6 생산 및 측정 대표 전염증성 시토킨으로 표시됩니다. * P에게 <0.05를 나타냅니다; 한 꼬리 학생의 T-테스트는 PBS 그룹에 자극 샘플을 비교. (Hjelm 외에서 수정하였습니다. 2010) 2.
그림 7. 3 차원 상피 세포의 모니터링 유전자 표현. progesterone 수용체 (PR) 단일층 표현 (ML) 또는 3 차원 인간의 질 상피 세포의 세미 정량 RT-PCR 분석. GAPDH는 하중 제어로 표시됩니다. 증폭 제품그림 30 PCR 사이클 이후에 발생하는 성적 표현의 결과입니다. 화살표는 3 차원 샘플에서 발생 PR 밴드로 포인트를 헤드.
그림 8. 3 차원 상피 세포의 단백질 발현 분석. 단일층 및 3 차원 인간의 질 상피 세포 전체 세포 lysates (30μg)의 서양 얼룩 분석은 안티 progesterone 수용체 (PR) 항체와 탐지. β-tubulin은 컨트롤을로드하는 프로브로 사용되었다.
9 그림. 세 가지 차원 인간 내피 세포 모델은 생산적인 바이러스 감염을 지원합니다. HSV-2 감염 3 차원 인간의 질 상피 세포 골재의 공촛점 immunofluorescence 현미경 이미지. 셀 2 시간, 한물간, 고정 24 H 게시물 감염 (4 % PFA)에 대한 방어 1.0에서 감염과 HSV-2는 특정 VP5 C 물들일되었습니다apsid 항체 (녹색)과 핵 얼룩 DAPI (파란색). 스케일 바 : 50 μm의.
10 그림. 유동세포계측법에 의한 3 차원 인간 내피 세포 모델에서 개별 세포 분석. () 단일층 또는 (b) 3 차원 인간의 질 상피 집계는 FITC 복합 MUC1 항체 (파란색), isotype 컨트롤 (녹색) 또는 PBS (적색)으로 표시, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 dissociated 있었고, FITC 표현식에 의해 계량되었다 유동세포계측법. 숫자는 isotype 컨트롤 스테인드 세포의 배경 형광 아웃 게이팅 후 남아 mucin 항체에 양성 물들일하는 세포의 비율을 나타냅니다. 비 균일한 봉우리는 이러한 세포의 표면에 glycosolation 패턴 및 MUC1 다양한 수준의 수많은 결과입니다.
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Discussion
여기에 제시된 RWV의 생물 반응기 기술의 활용은 더욱 생리학 관련 organotypic 세포 배양 모델은 현재 세포 배양 시스템을 발전하기 위해 능력과 연구자를 제공할 수 있습니다. RWV의 생물 반응기의 세포 배양 시스템이 꽉 분기점, mucin 생산, 세포외 프로세스 (예 : microvilli)와 세포 극성을 포함하여 생체내 같은 특성에서와 3 차원 세포 집합체를 형성하는 세포를있게 낮은 전단 microenvironment를 제공합니다. 여기에 제시된 데이터 및 예제 대부분 RWV 시스템에서 자란 질 상피 세포를 사용하고 있지만 RWV 시스템은 또한 소형 및 대형 소장, 폐, 방광, 간, 그리고 편도선 상피 세포를 포함한 문화의 다른 상피 세포 유형으로 사용되었습니다 3 차원 organotypic 모델 1, 7-13, 18를 형성합니다. 또한이 시스템은 상피 세포가 아닌 다른 문화 셀 유형으로 사용되고 있으며 복잡한 multicel의 현재 개발lular organotypic 문화 모델은 진행이 18입니다.
프로토콜은 가이드 역할을 의미하고 여기에 설명된, 그리고 관심있는 세포 유형을 기반으로 수정해야 할 수도 있습니다. RWV 시스템의 culturing 상피 세포에 대한 프로토콜에 대한 가장 일반적인 수정 초기의 세포가 STLV에서 배양해되는 시간의 길이, 결정과 STLV에서 하브로 집계 양도 타이밍, 그리고 셀 / 비드 비율을 포함 STLV에 퍼뜨리고. 성공적인 골재 형성을 위해 고려될 수 있습니다보다 전문적인 수정은 표면 면적, 직경, 모양, 표면 코팅, 밀도, 요금, 핵심 소재 및 공극률 등의 microcarrier 비드 혹은 비계의 속성입니다. 또한, 기본 배지, 제형 또는 보조 식품에 대한 조정, 문화 조건을 최적화하고 집계 형성을 최대화하기 위해 필요할 수 있습니다. 조정도에서 생물 반응기 시스템 및 그 구성 요소로 만들 수 있습니다생물 반응기 용기의 크기와 회전 속도를 cluding. 생물 반응기 내의 microenvironment의 강화된 평가 내용 perfused 문화 시스템은 집계 형성 원인이되는 환경을 보장하는 문화 선박 내의 산도, 산소 및 포도당 수준의 지속적인 모니터링에 대한 허용도 가능합니다. 문화 조건, 집계 형성, 세포 분화를 최적화하고 각각의 새로운 모델 시스템뿐만 아니라, 생물 반응기 시스템의 초기 비용을 특성화하기 위해 잠재적으로 긴 시간이 시스템에 주목할만한 단점이 있습니다. 그러나 실험실에서 구현하는 새로운 문화 시스템은 유사한 단점을 가지고 있습니다.
우리와 다른 인간의 세포를 이용 RWV 파생 모델은 약효, 독성과 인간 1, 2, 18와 관련된 패션 백신, microbicides, biologics 및 의약품의 pharmacokinetics을 예측하는 유용한 도구가 될 수도 것으로 나타났습니다. 회의 성공과 함께의 유연성과 결합 본격적인 인간의 반응을 생산하는 생물 반응기 배양 시스템입니다 RWV의 생물 반응기 시스템의 응용 프로그램은 현재 종양 모델링, 재생 의학, 조직 공학 2, 18-23 등의 분야로 확대되고 있습니다. 우리가 인간의 점막 조직의 구조와 기능을 모두 복제보다 복잡한 다세포 시스템을 만들 수 있도록 노력하고 우리 RWV 생성된 점막 모델을 진행합니다. 그러나 저자는 약물이나 백신은 인간의 생리적 시스템을 가지고 복잡한 상호 작용을 재현하기 위해 여러 모델 시스템을 활용하거나 통합할 필요가있을 수 있음을 인정합니다. 전체 RWV 생물 반응기 및 실험 응용 프로그램을 사용하여 우리의 목표는 더 점막 조직 생물학과 인간의 organotypic 모델의 환경 모욕에 대한 세포 반응을 이해하는 것입니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 자신의 단백질 분석을 위해 그녀의 기술력과 앤드류 라센 위해 브룩 Hjelm 감사드립니다. 이 작품은 대안 연구 개발 재단 (MMHK) 그랜트와 NIH NIAID 성병 감염 및 연고제 Microbicides 협동 연구 센터 IU19 AI062150-01 (MMHK)에 의해 부분적으로 재정 지원되었다. 우리는 기꺼이 그 인물의 재사용을위한 복제의 생물을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | Bio-Rad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR international | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | Bio-Rad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon International | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma-Aldrich | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR international | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Biosciences | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Biosciences | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Biosciences | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Biosciences | 352058 | |
| PR antibody | Dako | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR international | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | MedexSupply | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD Biosciences | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD Biosciences | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
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