Summary
Quantitativa reale tempo di reazione a catena della polimerasi (qPCR) è un metodo rapido e sensibile per indagare i livelli di espressione di microRNA (miRNA vari) molecole in campioni tumorali. Usando questo metodo di espressione di centinaia di molecole diverse miRNA possono essere amplificati, quantificati e analizzati utilizzando lo stesso modello cDNA.
Abstract
I microRNA (miRNA) sono a singolo filamento, lunghe 18-24 nucleotidi, non codificanti molecole di RNA. Essi sono coinvolti praticamente in ogni processo cellulare, compreso lo sviluppo 1, apoptosi 2 e regolazione del ciclo cellulare 3. MicroRNA sono stimati per regolare l'espressione del 30% al 90% dei geni umani 4 legandosi al RNA bersaglio loro messaggero (mRNA) 5. La diffusa disregolazione dei miRNA è stata segnalata in varie malattie e sottotipi di cancro 6. Grazie alla loro prevalenza e la struttura unica, queste piccole molecole sono suscettibili di essere la prossima generazione di biomarcatori, agenti terapeutici e / o obiettivi.
I metodi utilizzati per indagare l'espressione miRNA sono SYBR green I dye-based così come Taqman-probe qPCR based. Se miRNA devono essere efficacemente utilizzato in ambito clinico, è indispensabile che la loro rilevazione in campioni clinici freschi e / o archiviati essere precisa, riproducibile e specific. qPCR è stato ampiamente utilizzato per validare l'espressione dei miRNA nelle analisi dell'intero genoma, quali studi di microarray 7. I campioni utilizzati in questo protocollo provenivano da pazienti sottoposti a prostatectomia radicale per tumore della prostata clinicamente localizzato, ma in altri tessuti e linee cellulari possono essere sostituiti dentro i campioni della prostata sono stati snap-congelato in azoto liquido dopo la resezione. Le variabili cliniche e follow-up di informazione per ogni paziente sono stati raccolti per la successiva analisi 8.
Quantificazione dei livelli di miRNA in campioni tumorali della prostata. Le fasi principali nell'analisi qPCR dei tumori sono: estrazione di RNA totale, sintesi di cDNA, e la rilevazione dei prodotti qPCR miRNA utilizzando primer specifici. L'RNA totale, che include mRNA, miRNA, e altri piccoli RNA sono stati estratti da campioni usando il reagente TRIzol. Sistema miScript Qiagen è stato usato per sintetizzare cDNA ed eseguire qPCR (Figura 1). MiRNA endogeni non sono polyadenylated, quindi durante il processo di trascrizione inversa, un poli (A) polimerasi polyadenylates il miRNA. Il miRNA viene utilizzato come modello per sintetizzare cDNA utilizzando oligo-dT e trascrittasi inversa. Una sequenza tag universale della estremità 5 'del primer oligo-dT facilita l'amplificazione del cDNA in fase di PCR. Prodotto di amplificazione PCR viene rilevato dal livello di fluorescenza emessa da SYBR Green, un colorante intercalante che in DNA a doppio filamento. Primer specifici miRNA, insieme con un Primer universale che si lega alla sequenza di tag universale amplificare specifiche sequenze di miRNA.
I saggi Primer miScript sono disponibili per oltre un migliaio di umano-specifici microRNA, e centinaia di murina specifici miRNA. Metodo di quantificazione relativa è qui usato per quantificare l'espressione dei miRNA. Per correggere la variabilità tra campioni differenti, i livelli di espressione di un miRNA bersaglio viene normalizzato i livelli di espressione di un gene di riferimento. La scelta di un gene su cui normalizzare l'espressione di bersagli è critica nel metodo di quantificazione relativa analisi. Esempi di geni di riferimento tipicamente usati in questa capacità sono RNU6B piccolo RNA, RNU44, e RNU48 come sono considerati essere stabilmente espressa nella maggior parte dei campioni. In questo protocollo, RNU6B viene utilizzato come il gene di riferimento.
Protocol
1. Prostata Raccolta dei campioni
- Raccogliere i campioni prostata al momento della prostatectomia. Il campione è orientato con punti di repere anatomici. La prostata e delle vescicole seminali sono dipinti come segue: verde lato destro, blu lato sinistro.
- Una sezione centrale casuale trasversale della prostata è presa perpendicolarmente alla superficie rettale, congelato in azoto liquido e conservati a -80 ° C 9.
- Fette da banche di campioni sono fotocopiato, orientata (anteriore, posteriore, destro e sinistro), quadrisected. Le sezioni sono tagliati con il criostato.
- Le sezioni sono colorate con H & E e rivisto da un patologo per determinare e delineare le aree tumorali rispetto al normale sui vetrini colorati e una corrispondente immagine. Le aree marcate vengono utilizzati come guida per indicare le aree da cui estrarre il tessuto tumorale da cui RNA sarà estratto nelle fasi successive.
2. Isolamento RNA totale, con miRNA, da Campioni
- I campioni prostata Posizionare congelati su ghiaccio secco e riferendosi alla delineato fotocopia, taglio di una piccola porzione del tumore della prostata (tra 50 e 100 mg).
- Omogeneizzare il tessuto del tumore della prostata in 1 ml di reagente TRIzol. Le quantità nei passaggi seguenti si basano sull'uso di 1 ml di reagente TRIzol.
Nota: Qui abbiamo utilizzato reagente Trizol RNA per estrazione, tuttavia altri kit che isolano piccoli RNA contenenti RNA totale può anche essere usato.
- Incubare i campioni omogeneizzati per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 0,2 mL di cloroformio per i campioni e agitare vigorosamente per 15 secondi. Incubare campioni per 3 minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga a 12.000 xg per 15 minuti a 4 ° C.
- Trasferire la incolore fase acquosa superiore ai tubi freschi, e aggiungere 0,5 ml di alcool isopropilico.Incubare campioni per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga a 12.000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
- Aspirare accuratamente il sopranatante senza disturbare il pellet contenente l'RNA. Lavare il pellet di RNA con 1 mL di etanolo al 75%. Vortex il campione e ri-sedimento mediante centrifugazione per 5 minuti a 7.500 xg a 4 ° C.
- Aspirare accuratamente la supernatante e seccare il pellet di RNA per 5-10 minuti, assicurandosi che il pellet di RNA non è completamente asciutto. Re-sciogliere in acqua priva di nucleasi opportuno dimensione delle pastiglie. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop 1000 (misura assorbanza a 260 nm e 280 nm).
- Controllare la qualità e l'integrità dei campioni di RNA usando Agilent Bioanalyzer.
3. Trascrizione inversa di RNA
- Trascrizione inversa di RNA è stata effettuata utilizzando miScript Kit trascrizione inversa secondo le istruzioni del produttore (Qiagen). Questo kit comprende untrascrittasi inversa e un (A) poli polimerasi. Il tampone miScript RT include Mg 2 +, dNTPs, oligo-dT primer e primer casuali.
- Utilizzare tra 10 e 1 pg pg di RNA per sintetizzare cDNA. Se si utilizza più di 1 mg di RNA, la reazione scalare linearmente al volume adeguato.
- Preparare una master mix che contiene 5X miScript RT Buffer (4 pl), Mix Reverse miScript Trascrizione (1 pl), e RNasi-free acqua per portare le reazioni al volume finale di 20 microlitri. Includere anche RNA modello (fino a 1 mg) nel mix master.
- Incubare i campioni per 60 minuti a 37 ° C seguita immediatamente da una incubazione per 5 minuti a 95 ° C. Questa fase può essere eseguita in una macchina PCR, riscaldamento bagno blocco, o acqua. Termociclatori sono il metodo più adeguato e preciso. Conservare il cDNA su ghiaccio per breve termine, e -20 ° C per una conservazione a lungo termine.
4. Generazione di una curva standard
- Prima esperiiment con miRNA bersaglio, una curva standard è generata usando cDNA di concentrazioni note contro i loro punti di incrocio (CP) (Figura 2).
- Preparare una serie di diluizioni di 2 volte, 10-volte, 50-volte, 250-volte, e 1250 volte il cDNA originale di un campione che è noto per avere una espressione sostanziale del gene di interesse.
- Eseguire il PCR, come specificato nella sezione 5 "Real-time PCR per il rilevamento di miRNA", con la modifica che è cDNA in diluizioni seriali non una diluizione statica 40x.
- Eseguire l'analisi utilizzando il software RelQuant (Roche) per generare la curva standard.
Nota: una nuova curva standard deve essere generata per ogni gene di interesse.
5. Real-time PCR per il rilevamento di miRNA
- Real time PCR per miRNA è stata eseguita utilizzando miScript SYBR Green PCR Assay Kit e Primer miScript secondo le istruzioni del produttore (Qiagen). Preparare una master mix contenente2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x Primer miScript Universal, 10x Assay Primer miScript e acqua priva di RNasi. Preparare una master mix per una reazione di un volume di 20 microlitri.
- Il saggio Primer è specifico per il miRNA di interesse. Per Assay miScript 10x Primer ricostituire, centrifugare le provette brevemente e aggiungere 550 microlitri TE, pH 8,0. Vortex il flaconcino brevemente per miscelare, primer aliquote a volumi più piccoli, e conservare a -20 ° C. Due primer sono richieste:. Primer per il gene bersaglio e il gene di riferimento RNU6B è utilizzato così come il gene di riferimento.
- Diluire le aliquote di cDNA 40x e conservare supplementari a -20 ° C.
- serve cDNA come stampo per la PCR. Utilizzare 2 microlitri di 40x cDNA diluito e dispensiamo ai 20 pl luce cycler capillari (Roche).
- Aggiungere 18 microlitri della master mix per ogni capillare, e centrifugare utilizzando un adattatore capillare.
- Posizionare i capillari in un capillare basato Real-Time cycler, come LightCycler 3.5 Real-Time PCR System con un 32-capillare formato giostra.
- Eseguire il programma dei cicli di PCR come segue:
Per attivare polimerasi HotStarTaq che è in 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, pre-incubare a 95 ° C per 15 minuti.
Seguito da 50 cicli di:
Denaturazione, 15 s, 94 ° C;
Ricottura, 30 s, 55 ° C;
Extension, 30 s, 70 ° C. - Selezionare un campione di essere il calibratore, e impostare il suo valore normalizzato obiettivo a 1. Confrontare l'espressione relativa del miRNA in tutti gli altri campioni al calibratore.
Nota: In uno studio, lo stesso campione di taratura deve essere utilizzato per mantenere la consistenza dei risultati.
6. Analisi dei dati
- Curve di amplificazione per le reazioni PCR sono raffigurati graficamente e numericamente da Molecular Biochemicals versione software LightCycler 3,5 (Roche). Quantificare le reazioni nella scheda "quantificazione", unnd esportare i dati in un file di testo.
- Importare i dati al software di analisi RelQuant (Roche) per generare risultati quantificazione. Importare file separati per gene bersaglio, gene di riferimento, e dei dati della curva standard.
- Specificare la posizione del calibratore per bersaglio e gene di riferimento. Anche specificare le posizioni dei campioni. I dati sono espressi come la destinazione di riferimento rapporto di diversi campioni diviso per il bersaglio rapporto riferimento del calibratore. La curva standard precedentemente generato per un miRNA particolare e gene housekeeping è usato come standard di riferimento per estrapolare i dati quantitativi per gli obiettivi miRNA di concentrazioni sconosciute.
- Tre repliche di campioni vengono analizzati come gruppo e le concentrazioni medie e le deviazioni standard del triplice copia viene calcolato. Se uno dei triplicati è incompatibile con il resto del set, verrà escluso dal programma.
7. Risultati rappresentativi
<class p = "jove_content"> Un esempio di analisi su campioni qPCR prostata è mostrato in Figura 3. I risultati sono rappresentati numericamente, così come graficamente. I grafici che mostrano i livelli di espressione del gene di riferimento, U6, iniziano amplificazione esponenziale a circa ciclo 20, mentre l'espressione del gene bersaglio, miR-98, mostrato amplificazione ritardato circa al ciclo 25. I dati di questo esperimento è stato esportato come file di testo e analizzati dal software di analisi RelQuant. Posizioni del capillari contenenti il calibratore ei campioni sono specificati. Figura 4 illustra come il calibratore è impostato a 1, e l'espressione di altri campioni relativi al calibratore.
Figura 1. Varie fasi miScript trascrizione inversa e Real-time PCR.
Figura 2. Una curva standard è generata usando una serie di diluizioni di 2 volte, 10-volte, 50-volte, 250-volte, e 1250 volte il campione originale cDNA.
Figura 3. Roche Molecular LightCycler Biochemicals Software mostra le informazioni di tutto l'esperimento graficamente e dal testo. Quantitativi in tempo reale grafici di amplificazione PCR mostrano un aumento della fluorescenza da campioni diversi.
I dati Figura 4. Sono stati quantificati utilizzando RelQuant software di analisi LightCycler. Di solito, tre repliche di campioni vengono analizzati come un gruppo di campioni e che producono risultati chiaramente incoerenti sono escluse e le concentrazioni medie e le deviazioni standard del triplice copia viene calcolato.
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Discussion
Espressioni aberranti di alcune miRNA sono stati costantemente nei tumori della prostata rispetto al tessuto normale 10, e alcuni di questi miRNA sono stati nominati come potenziali agenti terapeutici nuovi contro il cancro della prostata 11. Quindi i livelli di espressione dei miRNA aberranti possono essere utili biomarcatori diagnostici e / o prognostico. The Real-Time qPCR metodologia qui presentata prevede un test per la quantificazione precisa dei livelli di miRNA nei tessuti tumorali della prostata. Il sistema miScript PCR utilizzato può rilevare singole differenze nucleotidiche tra miRNA maturi. I saggi miRNA qPCR miScript, tuttavia, non sono destinati per il rilevamento dei miRNA anello staminali precursori, per i quali diversi saggi precursori miScript sono disponibili.
L'affidabilità di questa tecnica dipende dalla qualità del RNA ingresso, quindi concentrazione, integrità, e la purezza di RNA deve essere testato prima Real-Time PCR. Inoltre, ribonucleasi sono molto Stable facilmente degradabile e RNA, quindi estrema cautela dovrebbe essere presa in gestione del RNA. Tutte le reazioni deve essere impostato su ghiaccio per minimizzare la degradazione dell'RNA. Inibitori di RNasi possono anche essere aggiunti alla reazione prima di trascrizione inversa. I guanti devono essere cambiati con frequenza, mentre articoli in plastica sterile e monouso deve essere utilizzato durante tutta la procedura.
Se non c'è prodotto PCR o la curva di amplificazione viene rilevato tardiva in Real-Time PCR, aumentare il numero di cicli di PCR, e assicurarsi che il programma bicicletta comprende l'attivazione di DNA polimerasi HotStarTaq per 15 minuti a 95 ° C. Amplificazione a basso potrebbe anche essere dovuto ad un'inadeguata modello di partenza cDNA, quindi cercare di aumentare la quantità di cDNA. Amplificazione tardiva può anche rappresentare un falso positivo.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Canadian Cancer Society Research Institute, concedere no. 019038.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 | |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 | |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 | |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche Group | ||
| Light Cycler Capillaries | Roche Group | 04929292001 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2538 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
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