Lavmolekylært Protein berikelse på mesoporous silika Thin Films for biomarkører

Summary

Vi utviklet en teknologi basert på mesoporous silika tynn film for selektiv gjenvinning av lavmolekylære proteiner og peptider fra humant serum. De fysisk-kjemiske egenskapene til våre mesoporous chips ble finjustert for å gi betydelig kontroll i peptid berikelse og dermed profilere serum proteomet for diagnostiske formål.

Abstract

Identifiseringen av sirkulerende biomarkører har et stort potensiale for ikke invasive metoder i tidlig diagnose og prognose, samt for overvåking av terapeutisk effektivitet. ^1-3 sirkulerer lav molekylvekt proteomet (LMWP) består av små proteiner kaste fra vev og celler eller peptidfragmenter avledet fra proteolytisk nedbrytning av større proteiner, har vært assosiert med patologisk tilstand hos pasienter og sannsynligvis reflekterer tilstanden til sykdommen. ^4,5 tross for disse potensielle kliniske anvendelser, til bruk av massespektrometri (MS) profilere LMWP fra biologiske væsker har vist seg å være svært utfordrende på grunn av det store dynamiske spekter av protein og peptid konsentrasjoner i serum. ⁶ Uten utvalg forbehandling, noen av de mer meget rikelig proteiner tilsløre påvisning av lavt overflod arter i serum / plasma. Gjeldende proteomikk-baserte tilnærminger, for eksempel to-dimensjonal polyakrylamid gel-electrophoresis (2D-PAGE) og hagle proteomikk metodene er arbeidskrevende, lav gjennomstrømming og tilbyr begrenset egnethet for kliniske applikasjoner. ^7-9 er derfor en mer effektiv strategi for å isolere LMWP fra blod og la high throughput screening av kliniske prøver .

Her presenterer vi en rask, effektiv og pålitelig multi-fraksjonering basert på mesoporous silika chips spesifikt mot og berike LMWP. ^10,11 mesoporous silika (MPS) tynne filmer med tunbare egenskaper på nanonivå ble fabrikkert med triblock copolymer malen veien . Bruke ulike polymer maler og polymer konsentrasjoner i forløperen løsningen, ble ulike porestørrelse distribusjonene, pore strukturer, tilkoblingsmuligheter og bakke egenskaper bestemmes og søkt om selektiv gjenvinning av lav masse proteiner. Den selektive analyseringen av de beriket peptider inn i ulike underklasser i henhold til deres fysiske og kjemiske egenskaper vil noHance effektiviteten av utvinning og påvisning av lav overflod arter. I kombinasjon med massespektrometri og statistikk analyse, viste vi sammenhengen mellom Nanophase egenskapene til mesoporous silika tynne filmer og spesifisitet og effekt av lav masse proteom høsting. Resultatene som presenteres her viser potensialet i nanoteknologi-baserte teknologi for å gi et kraftig alternativ til konvensjonelle metoder for LMWP høsting fra komplekse biologiske væsker. På grunn av evnen til å stille materialegenskaper, mulighet for lave kostnader produksjon, enkelhet og hurtighet av prøvetakingen, og de sterkt reduserte prøven krav til analyse, vil denne romanen nanoteknologi betydelig innvirkning innen proteomikk biomarkør forskning og klinisk proteomikk vurdering.

Protocol

1. Chip Fabrication

1. Lag belegg løsning for chip ved å starte med hydrolysert silikat forløperen løsning. Bland 14 ml av tetraethylorthosilicate (TEOS) med 17 ml etanol, 6,5 mL avionisert vann og 0,5 ml 6M HCl under sterk omrøring (1200 rpm) med en røre varm plate. Varm dette løsningen ved 80 ° C i 2 timer, holde omrøring konstant.
2. Forbered polymer-løsninger ved å legge inn ønsket tri-blokk coploymer (F127 pluronic, L121 og P123) til 10 ml etanol ved romtemperatur med sterke omrøring. Fyll blandingen ved å legge 7,5 ml av silikat løsningen (fra trinn 1,1) i tri-blokk kopolymer løsning etterfulgt av 2 timer med sterke risting ved romtemperatur. Dette representerer den endelige belegg løsningen.
3. Påfør 1 ml av belegg løsning til en 4 tommers silisium wafer av spin-belegg med en hastighet på 1500 rpm i 20 sekunder. Så varme ved 80 ° C i 12 timer.
4. Varm filmene for å fjerne organisk surfactant ved å heve temperaturen 1 ° C per minutt til 425 ° C, og deretter bake i 5 timer.
5. Pretreat den mesoporous silika (MPS) chip overflaten med oksygen plasma ashing (Plasma Asher - mars Plasma System). (O ₂ Flow rate: 80 SCCM, strøm: 300 W, tid: 10 minutter).
6. Valgfri overflate kjemisk modifisering: silanate chips i 3% organosilane i en Metanol: DI vann (19:01) løsning for 72 timer ved romtemperatur i en N ₂ hanskerommet. Skyll sekvensielt med metanol og DI vann. Cure chips ved 110 ° C i 15 minutter i en fan-opererte ovnen.

2. Eksempel Pre-behandling

1. Legg TFA og ACN til hver serumprøve slik at de endelige konsentrasjonene er 0,01% TFA og 5% ACN. Vortex å blande.
2. Rist disse prøvene på et bord vortex shaker ved romtemperatur i 30 minutter.

3. Serum Fraksjonering

1. Pre-bake chips over natten i en ovn ved 160 ° C. Alternativt Store chipsene i en eksikkator før bruk for å hindre fuktighet fra overflaten ved ambient vann i luften.
2. Bruk trykkluft til å tørke støv av eventuelle partikler som kan være på overflaten av brikken.
3. Skjær prefabrikkerte kjøpte CultureWell kammer coverglass å inkludere ønsket antall brønner. Clean coverglass med 100% etanol og deretter plass på MPS chip overflaten. Trykk coverglass ned med tang for å sikre en fullstendig forsegling med chip.
4. Pipetter 10 mL av serum prøve til hver 3 mm brønn. Inkuber i 30 minutter i en fuktet kammer ved romtemperatur.
5. Pipettering opp serum fra brønner og kast. Pipetter 10 mL av avionisert vann til hver brønn for å vaske bort større proteiner. Gjenta 4 ganger.
6. Pipetter 5 mL eluering buffer (0,1% TFA + 50% ACN) til hver prøvebrønnen. Pipettering opp og ned 30 ganger mens du beveger pipettespissen rundt i brønnen for å blande eluering buffer. (Kun gjelder eluering buffer til 1-2 prøver på et tidspunkt for å hindre eluering bufferfordamper så fort).
7. Etter blanding pipetter alle eluering buffer og plass i en mikrosentrifuge rør til den er klar til å utføre MALDI-TOF analyser.
8. For å etterligne kompleksiteten i en biologisk prøve og å vurdere berikelse effekten i høstingen lavmolekylære arter med vår on-chip fraksjonering system, valgte vi og montert en standard blanding av proteiner og peptider telle tjueseks forskjellige arter med en bred spekter av molekylvekt (900-66 500 Da) og proteasehemmere (4,0 til 10,2) og konsentrasjoner (0,5 til 8 pmol / mL) (se protein listen i tabell 1).

4. MALDI-TOF Analyse av Peptider

1. Spot 0,5 mL av prøven som MALDI sikteplate og la tørke.
2. Spot 0,5 mL matrise (α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA), 5 g / L) eller mettet løsning av trans-3 ,5-Dimethoxy-4-hydroxycinnamic syre (SA) i 50% acetonitril inneholder 0,1% TFA og tillate å co-krystallisering. </ Li>
3. Spot 0,5 mL av kalibreringsløsning til hver kalibrering sted og la tørke.
4. Sett sikteplate inn MALDI-TOF massespektrometer. Maskinen skal settes til positiv reflektor modus med en laser intensitet av 4200 og 3000 skudd per prøve. Den valgte masse området bør være 800-5000 Da med ett mål masse av 2000 Da.
5. Utfør samme MALDI-TOF analyser i lineær modus, men endrer masse rekkevidde til 900 til 10.000 Da eller 3000 til 70.000 Da og et mål masse på 5000 Da.

5. Data Analysis

1. Den rå spektra ble behandlet med ConvertPeakList programvare og dataene ble eksportert til SpecAlign programvare for forbehandling. All spektra ble justert ved hjelp av PAFFT korrelasjonen metoden og intensiteter ble normalisert til total ion strøm (TIC) i hver tilsvarende spektrum. All spektra ble glattet og de-noised med faktor på 4 og 0,5 kroner. Peaks ble oppdaget med en baseline på 0,5, masse vindu på 21 og høyderatio 1,5, ble negative verdier fjernet før analysen.
2. Hierarkisk clustering ble utført ved hjelp Cluster 3.0 og visualisert med MapleTree programvare. MALDI MS Data (m / z peak intensitet) var logge forvandlet, normalisert, og median sentrert. Pearson korrelasjon ble brukt til å beregne avstanden mellom prøvene, og komplett kobling clustering ble utført.
3. En uavhengig Student t-test ble brukt for sammenlikning mellom grupper (n = 2 grupper) for hvert oppdaget MS topp før unsupervised hierarkisk klynging analyse. En P-verdi på 0,02 eller lavere ble betraktet som signifikant for å velge forskjellig høstes peptider og proteiner blant de forskjellige mesoporous proteomikk chips (store porer vs små porer).

6. Representative Resultater

Som vist i figur 1, i denne studien fabrikkert vi en serie av mesoporous silika tynne filmer med en rekke nanotextures og grundig utforsketir bruk i selektiv fangst og berikende LMW peptider og proteiner fra humant serum. Figur 2a og b viser MS spektra av ubehandlet serumprøve for peptider i området 900 til 10.000 Da og for proteiner i størrelsesorden 3000 ~ 70000 Da henholdsvis . Disse spektrene illustrere signalet undertrykkelse i LMW regionen på grunn av tilstedeværelsen av brønn ionisert, svært rik, høy molekylvekt (HMW) proteiner som albumin. Figur 2c og d skildrer MS spektra av serum etter fraksjonering av MPS L121 (pore størrelse, 6 nm). Flertallet av de store molekyler har blitt tømt, noe som resulterer i en betydelig berikelse av LMW komponentene. Som en kontroll ble det samme serumprøve påføres på en nonporous ren silika overflaten for å vurdere spesifisiteten av MPS tynne filmer for LMWP utvinning. Som kan sees i figur 2e og f, var det ingen signifikant høsting av tiltakslysttidevann eller proteiner fra nonporous silika. Dermed kan det konkluderes med at det var mesoporous arkitektur og ikke silika overflaten affinitet som utgjør den dominerende faktor i anriking av LMWP.

Kontrolleres nøyaktig variasjoner i porestørrelse kan oppnås gjennom bruk av kopolymerer med ulik hydrofobe blokk lengder. Ved å bruke de utformede proteiner og peptider blandingen, ble effekten av pore størrelse på LMW peptid og protein utvinning effekt undersøkt ved hjelp av MPS tynne filmer forberedt fra fire Pluronic tensider (F127, P123, L121, L121 og pluss hevelse middel) med ulike volum forholdstall av hydrofile og hydrofobe komponenter for å danne porestørrelser på 3,7 nm, 5.2 nm, 7.4 nm og 9,0 nm henholdsvis. Dette utvalget av porestørrelser førte til utvinning av en annen repertoar av peptider og proteiner fra samme serumprøve via størrelse og form ekskludering (figur 3). Proteinet spektra ved høy molekylvekt demonstrate den molekylære cut-off av hver type chip. I tillegg til størrelsen avhengig uttømming av HMW proteiner, viser on-chip fraksjonering av standarder løsningen en differensial og selektiv anrikning av LMW arter knyttet til porestørrelser. De to-veis hierarkisk clustering presentert i figur 3b viser LMW standarder berikelse mønster oppnådd med de forskjellige MSC. Selv om alle peptider er under molekylær cut-off av chips, det er en positiv korrelasjon mellom de porestørrelser og molekylvekten av de fangede arter. MSC med store porer, opptil 9 nm, fortrinnsvis høste større peptider, mens mindre peptider er gjenvunnet mer effektivt ved chips med mindre porer. Det strukturelle transformasjonen av mesoporous ordningen ble utført ved å justere konsentrasjonen av malen polymer. Øke konsentrasjonen av malen polymer resultert i redusert grenseflatespenning kurvatur mellom faseneav vann, copolymer, og silikat, dermed initiere innbyrdes progresjon fra en sfærisk til en sylindrisk struktur. Pluronic F127, med sin høye molekylvekt, besitter denne høye graden av strukturelle periodisitet. Ved å øke konsentrasjonen av F127 i start-løsning, kan ulike MPS tynnfilm periodiske nanostrukturer hentes fra 3D nanostrukturen til 2D nanostrukturen. 3D kubikk og honeycomb sekskantede nanostrukturer, inneha mer ønskelig nanopore sammenkopling og mer tilgjengelig nanopore morfologi, viser overlegen ytelse i selektivt berikende LMW peptider enn 2D sekskantede strukturen, selv om de deler lignende porestørrelse distribusjoner og de samme molekylære cut-off for serum fraksjonering (figur 4). Vi har også effektivisert konjugering av organo-silan på MPS chips ved å innføre oksygen plasma Foraskning til pretreat brikken overflaten. For å kvalitativt studere den elektrostatiske effekt på selective on-chip berikelse, bruker vi de proteiner og peptider blanding. MS analyse av proteomikk standarder løsningen fraksjonert på MPS chips tilberedt med L121 og konjugert med de kjemiske funksjonelle grupper er presentert i figur 5. De positivt ladede og negativt ladet peptider og LMW proteiner er fanget på den anioniske og kationiske chips henholdsvis. Den kvantitative sammenligning av flere MPS chips i utvinne peptider med positive netto kostnad vises i figur 5a. Flisen med negativ ladning og chips uten modifisering (med en mindre negativ ladning opprinnelig) viser signifikant høyere berikelse for de peptider enn chips modifiserte med APTES (-NH _2). Motsatt, de positivt ladede MPS chips besitte eksepsjonell evne til å gjenopprette disse peptider med negativ netto kostnad, som demonstrert i Figur 5b. Mens α-endorfin ikke viser en betydelig endring due til sin PI rundt seks.

Figur 1. Prinsippet MPS chips fraksjonering og LMW berikelse. Etter prøven spotting på overflaten, er LMW proteiner og peptider fanget i porene, mens de større artene forble utenfor porene og blir fjernet i løpet av de vaske trappen. De beriket fraksjoner blir så eluted og analysert av MALDI.

Figur 2. Peptide berikelse bruke mesoporous silika tynnfilm chips. MALDI MS profiler i både lav masse rekkevidde (900 til 10 000 Da) og den høye massen området (3000-70 000 da) før (a, b) og etter (c, d) serum prosessering på mesoporous silika tynne filmer ( L121, 6 nm). Den molekylære utvinning er betydelig redusert når du bruker blanke nonporous silika overflater (e, f).

Figur 3. Molecular cut-off og størrelse-avhengig anrikning av MPS chips. (A) Forstørret visning av MALDI spektrene viser den karakteristiske molekylær cut-off av hver MPS chips sammenfaller med porestørrelse. (B) To-veis hierarkisk clustering av peptid mix funksjoner mellom de forskjellige chips. Intensiteten av den røde eller gule fargen indikerer den relative peptid konsentrasjon. Større porer forbedret høsting av større peptider (3600-8500 Da), mens de små peptider (900-3500 Da) ble fortrinnsvis gjenvunnet fra chips med mindre porer.

Figur 4. Fysiske karakterisering av MPS tynne filmer og selektiv utvinning med ulike nanostrukturer. XRD mønstre (a, b, c), TEM (innfelt a, b, c), F127 Pluronic på ulike konsentrasjoner i forløperen løsningen: 4,0 ×10 ^-3 M (a), 6,0 × 10 ^-3 M (b), og 8,0 × 10 ^-2 M (c). (D) Bar grafen intensiteten påvisning illustrere selektiv peptider utvinning på 3D kubikk og 3D sekskantede F127 proteomikk chips (Cub og Hex, henholdsvis). De ulike strukturelle endringer presentere en selektiv berikelse.

Figur 5. Charge-spesifikk utvinning for de chips med forskjellige overflate funksjoner. Søylediagram av MS intensitet av påvisning av selektivt fanget peptider på functionalized chips. Ifølge deres iso-elektrisk punkt, peptider er positivt eller negativt ladet ved pH 7,0. (A) Positive peptider ((1) des-ARG1-bradykinin, (2) bradykinin, (3) substans P-amide, (4) Neurotensin, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)) er spesielt beriket på negativt ladet suransikter. (B) Negative peptider ((7) Glu1-fibrinopeptide B, (8) α-endorfin, (9) ACTH (18-39), (10) insulin, (11) EGF, (12) insulin-like GFII) er spesifikt beriket på de positivt ladde overflater.

Figur 6. On-chip stabilisering av fraksjonert serum. (A) Representative MALDI profiler av LMW peptider og proteiner eluted umiddelbart etter serum fraksjonering (øverst) eller etter 3 ukers on-chip oppbevaring i romtemperatur (nederst). (B) Fra topp til bunn: Lineær regresjonsanalyse av gjennomsnittlig intensitet på oppdagede MS topper i hver gjengivelse i forhold til å gjenskape en for fersk fraksjonert serum og fraksjonert serum etter 3wk MPS chips lagring ved romtemperatur. Ligning, CV og koeffisienten (R ²⁾ er angitt.

Discussion

Bevis er montering at lav molekylær vekt regionen sirkulasjons proteomet er en rik kilde til diagnostiske biomarkører for tidlig påvisning av sykdom. I denne teknologien, presenterte vi en rekke mesoporous silika chips med forskjellige porestørrelser og pore strukturer og modifikasjoner for å selektivt beriker peptider og lavmolekylære proteiner. For å evaluere protein stabilitet, ble MPS chips inkubert med humant serum, tørket etter vask, og lagres for 3wk ved romtemperatur. De protein / peptid mønstre oppnådd var sammenlignbare med de av fersk fraksjonert serum (figur 6a), som bekreftet av resultatene av den statistiske analysen viste i figur 6b. Den variasjon av Peak signaler målt ved gjennomsnittlig CV ble anslått til 12,7% for råolje serum og 14,2% for de fraksjonert prøvene. De marginale variasjoner kan skyldes den interne variasjonen i MALDI instrument og foreslo at on-chip forbehandling og lagring fremkalte ikke noen vesentlig endring av MS protein profiler. Det samme forsøket er utført på ikke porøst silisium. Den tørkede serum gjenfunnet etter lagring på silisium overflate var fraksjonert på MPS chips før MALDI analyse. Den stakkars MS profilen innhentet viste stabilisering nytte av mesoporous overflaten. I analogi med tidligere antatte mekanismer, hypoteser vi at LMW artene fanget inne i nanopores ble bevart fra degradering gjennom størrelsen eksklusjon av proteaser, eller ved steric hemming av deres proteolytisk aktivitet i lukkede rom av nanopores. MPS chip metode kan være et kraftig verktøy i peptid og LMW protein profilering av komplekse biologiske væsker studie. MPS chips er billig å produsere og gi rom for skalert opp produksjonen for å oppnå samtidig behandling av et stort antall prøver, og gir fordelaktige egenskaper for utforskende screening og biomarkør oppdagelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetraethoxysilane	Sigma-Aldrich	131903	98%
Spin coater	Brewer Science, Inc.	Cee 200X
Plasma Asher	Nordson March	AP-600
Spectroscopic Ellipsometer	J. A. Woollam Co.	M-2000DI
MALDI-TOF	Applied Biosystems	Voyager-DE-STR
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma-Aldrich	C8982	Matrix for MALDI-TOF
trans-3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid	Sigma-Aldrich	85429	Matrix for MALDI-TOF
Stir hot plate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	11-475-30Q
CultureWell chambered coverglass	Sigma-Aldrich	GBL103350	3 mm diam. ×1 mm depth, 3-10 μL, sterile
Pluronic F 127	BASF		PEO106-PPO70-PEO106
Pluronic L121	BASF		PEO5-PPO70-PEO5
Pluronic P123	BASF		PEO20-PPO70-PEO20
Table 1. Physico-chemical properties and designed concentrations (Molecular weight and Iso-electric point) of the selected peptide and protein standards.