Aqui nós descrevemos um método rápido e simples para medir a rigidez da célula. O princípio geral da presente abordagem é a de medir a deformação da membrana em resposta ao bem definido de pressão negativa aplicada por meio de uma micropipeta para a superfície celular. Este método fornece uma ferramenta poderosa para estudar as propriedades biomecânicas do substrato anexados células.
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Artigo de método
Aspiração micropipeta de Células-substrato anexados para Estimar Rigidez celular
Neste artigo
Resumo
Resumo
Número crescente de estudos mostram que as propriedades biomecânicas de células individuais desempenham um papel importante em várias funções celulares, incluindo proliferação, diferenciação, migração e interações célula-célula. Os dois principais parâmetros de biomecânica celulares são deformabilidade celular ou a rigidez e a capacidade das células para se contrair e gerar força. Descrevemos aqui um método rápido e simples para estimar a rigidez das células pela medição do grau de deformação da membrana em resposta à pressão negativa aplicada por uma micropipeta de vidro à superfície da célula, uma técnica que é chamado de aspiração por micropipeta ou microaspiração.
Microaspiração é realizada puxando um capilar de vidro para criar uma micropipeta com uma ponta muito pequena (2-50 um de diâmetro, dependendo do tamanho de uma célula ou de uma amostra de tecido), o qual é então ligado a um transdutor de pressão pneumática e levada para um próximo vizinhança de uma célula sob um microscópio. Quando oponta da pipeta toca uma célula, um passo de pressão negativa é aplicada à pipeta pelo transdutor de pressão pneumática gerando pressão bem definida sobre a membrana celular. Em resposta à pressão, a membrana é aspirada para a deformação da membrana da pipeta e progressivo ou "membrana de projecção" na pipeta é medido como uma função do tempo. O princípio básico desta abordagem experimental é que o grau de deformação da membrana em resposta a uma força mecânica definida é uma função da rigidez da membrana. A membrana é mais rígida, mais lenta a taxa de deformação da membrana e quanto menor for o estado estacionário técnica comprimento.O aspiração pode ser realizada em células isoladas, quer em suspensão e substrato-conectados, organelas grandes, e lipossomas.
A análise é efectuada por comparação da deformação da membrana máxima conseguida sob uma dada pressão para diferentes populações de células ou de condições experimentais. Um "coeficiente de rigidez" é esestimada a locando o comprimento aspirado de deformação da membrana como função da pressão aplicada. Além disso, os dados podem ser ainda analisada para estimar o módulo de Young das células (E), o parâmetro mais comum para caracterizar a rigidez dos materiais. É importante notar que as membranas plasmáticas de células eucarióticas pode ser visto como um sistema bi-componente, onde bicamada lipídica da membrana está subjacente se o citoesqueleto da membrana sub-e que é o citoesqueleto, que constitui o andaime mecânico da membrana e domina a deformabilidade do envelope celular. Esta abordagem, portanto, permite sondar as propriedades biomecânicas do citoesqueleto sub-membrana.
Protocolo
1. Puxando micropipetas de vidro
Equipamento: Micropipeta Puller, Microforge.
Vidro: Boroscillicate capilares de vidro (~ 1,5 mm de diâmetro externo, diâmetro interno de 1,4 mm ~).
- Micropipetas são puxados usando a mesma abordagem básica que é usada para preparar microeletrodos de vidro para gravações de eletrofisiologia. Resumidamente, um capilar de vidro é aquecido no meio e, quando o vidro começa a derreter as duas metades do tubo capilar são separadas gerando duas micropipetas. Vários puxadores comerciais estão disponíveis para executar esse pro....
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Discussão
Microaspiração proporciona um método simples e altamente reprodutível para estimar a rigidez das células / deformabilidade por aplicação de pressão negativa a uma membrana celular e de medição da deformabilidade da membrana em resposta à pressão bem definida. Ele foi desenvolvido por Mitchison e Swann (1954) para caracterizar as propriedades elásticas do mar, ouriços-do-ovos para fornecer insights sobre os mecanismos de divisão celular 21 e depois de olhar para as propriedades mecânicas em células vermelhas d.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Catálogo / Número modelo | Comentários |
| Sutter pipeta extrator | Sutter Instruments | P-97 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Microscópio Fluorescente invertido | Zeiss | Axiovert 200M | O microscópio deve ser de preferência equipado com capacidades 3D/deconvolution. |
| Videocamera | Zeiss | AxioCam MRM | |
| Aquisição de Imagem sotware | Zeiss | AxioVision | |
| Transdutor de Pressão Pneumático | BioTek | DPM-1B | DPM1B Tester transdutor pneumático agora pode ser encontrado por acaso. |
| Pipeta de vidro | Richland | Vidro personalizado | Pipetas foram personalizadas com um diâmetro de 1,2 e 1,6 de diâmetro interior exterior. |
| DiI Dye | Invitrogen | D282 | Dissolve-se bem em DMSO |
Referências
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. I. Membrane stiffness and intracellular pressure. Biophys. J. 4, 115-135 (1964).
- Discher, D. E., Mohandas, N., Evans, E. A. Molecular maps of red cell deformation: hidde....
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Reimpressões e permissões
