Spectral karyotyping (SKY) er en avanceret cytogenetik teknik til at identificere genomiske og kromosomforandringer. Denne teknik drager fordel af kromosom maleri prober, hvilket muliggøre klassificering af alle kromosomer. SKY kan også identificere komplekse kromosomafvigelser og adskillelse mangler i mus og mennesker med forskellige sygdomme, herunder polycystisk nyresygdom.
Konventionel metode at identificere og klassificere individuelle kromosomer afhænger af den unikke banding mønster af hvert kromosom i en specifikke arter, der analyserede 1, 2. Denne klassiske banding teknik, imidlertid, er ikke er pålidelig i at identificere komplekse kromosomforandringer såsom dem associeret med cancer. For at overvinde de begrænsninger af banding teknik, er Spectral karyotyping (SKY), indført til at give meget pålidelige oplysninger om kromosomfejl.
SKY er en flerfarve fluorescens in-situ hybridisering (FISH) teknik til at detektere metafasekromosomer med spektral mikroskop 3, 4. SKY har vist sig at være et værdifuldt værktøj til cytogenetisk analyse af en bred vifte af kromosom abnormiteter i forbindelse med et stort antal af genetiske sygdomme og maligniteter 5, 6. SKY involverer anvendelsen af flerfarvede fluorescens-mærkede DNA-prober fremstillet ud fra den degenererede oligonucleotide primere ved PCR. Således, hver kromosom har et unikt spektral farve efter in-situ hybridisering med prober, der er differentielt mærket med en blanding af fluorescerende farvestoffer (Rhodamin, Texas Red, Cy5, FITC og Cy5.5). Proberne, der anvendes for SKY bestå af op til 55 kromosomområder specifikke prober 7-10.
Den Proceduren for SKY involverer flere trin (figur 1). SKY kræver tilgængeligheden af celler med højt mitotisk indeks fra normalt eller sygt væv eller blod. Kromosomerne af en enkelt celle fra enten en frisk isoleret primær celle eller en cellelinie er spredt på et objektglas. Dette kromosom spread er mærket med en forskellig kombination af fluorescerende farvestoffer specifikke for hvert kromosom. Til detektering og image erhvervelse består spektral imaging system sagnac interferometer og et CCD-kamera. Dette tillader måling af det synlige lysspektrum udsendt fra prøven og til at erhverve en spektral billede tilbagem. individuelle kromosomer. HiSKY, den software, der bruges til at analysere resultaterne af de billeder, giver det let at identificere kromosom anomalier. Slutresultatet er en metafase, og en karyotype klassifikation billede, i hvilken hvert par af kromosomer har en distinkt farve (figur 2). Dette giver mulighed for nem identifikation af kromosom identiteter og omplantning. For flere detaljer, kan du besøge Applied Spectral Imaging hjemmeside ( http://www.spectral-imaging.com/ ).
SKY blev for nylig anvendt til en identifikation af kromosom adskillelse fejl og kromosomfejl hos mennesker og mus med autosomal dominant polycystisk nyresygdom (ADPKD), en genetisk sygdom karakteriseret ved dysfunktion i primære cilier 11-13. Ved at bruge denne teknik, vi viste tilstedeværelsen af unormal kromosom segregering og kromosomfejl i ADPKD patienter og musemodeller 14. Yderligere analyser anvender SKY ikke kun lov for os at identificere kromosomalt antal og identitet, men også nøjagtigt at detektere meget komplekse kromosomforandringer såsom kromosomområder deletioner og omplantning (figur 2).
Spectral karyotyping (SKY) er en cytogenetik teknik, der anvendes i at studere genomiske og kromosom-kompositioner. Denne teknik drager fordel af kromosom maleri prober, og påvisning af disse prober er erhvervet gennem en sagnac interferometer. Den komplette SKY proces tager normalt omkring en uge, og det indebærer flere vigtige skridt (figur 1). Det SKY bruger en standard protokol, som første gang blev beskrevet af Padilla-Nash et al 3. Protokollen er siden blevet tilpasset af fo…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi og Blair Mell for deres tekniske assistance. Dette arbejde blev støttet af priser fra NIH (DK080640) og The University of Toledo & ProMedica Translationel Forskning Stimulation Award til Dr. Surya Nauli.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
DMEM | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
Penecillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
Colcemid | Roche Diagnostics | 10 295 892 001 | 10 μg/ml |
HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
SKY paint probe kit (Human) | Applied Spectral Imaging | SKY000028 | |
SKY paint probe kit (Mouse) | Applied Spectral Imaging | SKY000030 | |
Concentrated antibody detection kit | Applied Spectral Imaging | SKY000033 | |
Trypsin | Thermo Scientific | SH30236.01 | |
Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
RNase A | Roche Diagnostics | 10 109 169 001 | |
Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
MgCl2 | Fluka | 63069-500ML | |
37% Formaldehyde | Mallinckrodt Baker | 2106-02 | |
20X SSC | Promega | V4261 | |
Formamide | Fluka | 47671 | prepare just before use |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Microscope glass slides | Fisher Scientific | 12-549 | |
Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
Rubber cement | Elmer’s (local retail store) | ||
Hybridization/ humidifiedchamber/Tray | Simport | M920-2 | put wet paper towels at the bottom |
Thermocycler | Eppendorf | Epgradient S | |
Shaking platform/Orbital shaker | Bellco Biotechnology | ||
Shaking/water bath | Precision Scientific | ||
DAPI filter cube | Chroma Technology | ||
SKY filter cube | Chroma Technology | ||
SpectraCube | Applied Spectral Imaging | ||
Inverted cell culture microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS100 | |
Fluorescence microscope | Olympus | IX70 | 60X oil |