A pesar de los esfuerzos en curso a las culturas de transición a la alimentación libre de condiciones, la derivación y la cultura de células madre embrionarias humanas (hESC) siguen siendo en gran parte dependiente en co-cultivos con alimentadores de embriones de ratón (MEFs). A continuación, se muestra una nueva metodología para la rápida eliminación de los alimentadores a partir de cultivos celulares de grado terapéutico antes de la experimentación.
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Artículo de método
La eliminación rápida de fibroblastos de alta densidad Humanos culturas de células madre embrionarias
En este artículo
Resumen
Resumen
Fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) se utilizaron para establecer células madre embrionarias humanas (hESCs) los cultivos tras el aislamiento de blastocisto 1. Este sistema de alimentación mantiene hESCs de someterse a la diferenciación espontánea durante la expansión celular. Sin embargo, este método de co-cultivo es laborioso, requiere de personal altamente capacitado y pureza rendimientos hESC bajo 4. Muchos laboratorios han intentado reducir al mínimo el número de células de alimentación en cultivos de células madre (es decir, la incorporación de la matriz platos recubiertos o otros tipos de células alimentadoras 5-8). Estos sistemas de cultivos modificados han mostrado cierta promesa, pero no han suplantado el método estándar para el cultivo de hESCs con mitomicina C tratados con fibroblastos de ratón embrionaria, con el fin de retardar la diferenciación espontánea no deseada de los cultivos de células madre. Por lo tanto, las células de alimentación utilizados en la expansión de células madre debe ser removido durante experimentos de diferenciación. Aunque se dispone de varias técnicas para purificar el co hESClonies (FACS, Mac, o el uso de vectores resistentes a los fármacos) de los alimentadores, estas técnicas son mano de obra intensiva, costosa y / o contrarios a la hESC. El objetivo de este proyecto era inventar un método de purificación que permite la recolección de una población pura de hESCs. Hemos observado que en un cultivo confluente hESC, la población MEF se puede eliminar mediante una aspiración simple y rápido de la hoja de MEF. Esta eliminación es dependiente de varios factores, incluyendo lateral de célula a célula de unión de MEFs que tienen una menor afinidad de unión a la placa de cultivo de estireno, y la capacidad de las colonias de células madre para empujar los fibroblastos hacia el exterior durante la generación de su propio " nicho ". El hESC fueron examinados por SSEA-4, Oct3 / 4 y expresión Tra 1-81 hasta 10 días después de la eliminación del MEF para asegurar el mantenimiento de la pluripotencia. Por otra parte, las colonias de células madre fueron capaces de continuar creciendo en grandes formaciones de después de la eliminación MEF, que proporciona un nivel adicional de expansión hESC.
Protocolo
1. Preparación de los Alimentadores de embriones de ratón
- El MEFs utilizado en el co-cultivo de hESCs debe ser previamente tratada por irradiación o mitomicina C para inhibir las células de sufriendo división.
- Dos horas antes de la siembra MEF, bata de cada plasma de 60 mm placa de cultivo tratado con 2 ml de gelatina al 0,05%.
- Descongelar un vial de MEFs tratada y placas a ~ 20.000 células / cm 2.
- Permitir que las células se adhieran durante la noche.
2. Siembra Co-hESCs en MEFs
- Las nuevas colonias se puede iniciar a partir de cultivos crioconservados o pases culturas a....
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Discusión
El método presentado en este manuscrito ofrece una alternativa rápida y menos costosa para la eliminación de células alimentadoras de fibroblastos humanos de cultivos de células embrionarias. La eliminación exitosa de los fibroblastos es dependiente de la existencia de una monocapa confluente herméticamente de estas células que se desarrolla en más cultivos de células madre. Después de 7-10 días, las colonias que crecen hESC empujará los fibroblastos de conexión en una dirección hacia fuera, la generación de una monocap.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por una Nueva Facultad II Premio del Instituto de Medicina Regenerativa de California (RN2-00921-1), y un premio financiado por los NIH de Investigación Nacional (F32-HL104924)
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Fibroblastos Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Núcleo Celular Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Marcador de diferenciación temprana |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
Tabla 1. Tabla de razones específicascaballeros utilizada para la inmunotinción hESC.
Referencias
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blas....
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