Summary
Mitochondrien-Fusion wurde durch das Verfolgen der Äquilibrierung von photokonvertiertem Matrix-bezogenen GFP über die mitochondriale Netzes über die Zeit gemessen. Bisher konnte nur eine Zelle zu einer Stunde lange kinetische Analyse bei einer Zeit unterworfen werden. Wir präsentieren eine Methode, die misst gleichzeitig mehrere Zellen und beschleunigt so den Prozess der Datensammlung.
Protocol
1. Image Plate Vorbereitung
- Kultur INS1 Zellen in RPMI-Medium, enthaltend 10% fötales Rinderserum Standard, 1% Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 5 mM NaHCO 3, 2 mM HEPES, 2 mM Brenztraubensäure und 11 mM Glucose bis 80% Konfluenz.
- Trypsinieren die INS1 Zellkulturen, die mit 0,05% Trypsin und Platte ihnen auf Poly-D-Lysin-beschichteten Deckglas-Boden Speicherfolien (30-40% Konfluenz).
- Lassen Sie für Teller 60-80% Konfluenz (~ 2 Tage) zu erreichen und fügen mitochondrialen Matrix gezielt (COXVIII) adenoviralen PA-GFP für 24 Std. (MOI = 5). Exchange-Medien und ermöglichen Zellen für weitere 2 Tage vor der Bildgebung zu wachsen.
- Am Tag der Bildgebung, fügen 7-15 nM TMRE zu den Speicherfolien und Gleichgewicht für mindestens 45 min.
- Während dieser Zeit wiederum auf dem Inkubator (Stufe oberen Inkubator wurde hier verwendet) und ermöglichen das Mikroskop auf 37 ° C für etwa 1 Stunde lang äquilibrieren. Schalten Sie die 5% CO 2.
2. Bildparameter für die Zeiss LSM 710 konfokalen Mikroskop
- Nach dem Mikroskop hat äquilibriert, unter der Erwerb Registerkarte auf "show Handwerkzeugen" klicken, öffnen Sie die Imaging-up-Panel eingestellt, und wählen Sie "Kanal-Modus" wechseln und verfolgen jeden "Frame".
- Im Lichtweg-Panel, wählen und LSM-Channel-Modus. Arbeiten von der Probe nach oben Symbol, wählen Sie "hinten", MBS-690 +, 488 und MBS. An der Unterseite des Panels, wählen Sie "T-PMT", um die Visualisierung des Hellfeld oder DIC-Kanal zu ermöglichen.
- Fertig zur Anpassung der Lichtweg-Parameter durch Einstellen des Bereichs für das GFP-Farbstoff 490-540 nm und 580-700 nm für die TMRE Farbstoff.
- In der Übernahme-Modus, verwenden Sie ein 512 × 512 Pixel Scanfeld, durchschnittlich 4x, und wählen Sie einen Zoom-Faktor (die Sie behalten möchten, für die Kalibrierung konsistent).
3. Die Optimierung der Bildparameter
- Mit dem Plan Achromat 100x (1,4 NA) Objektiv, focuns auf Ihre Zellen mit dem Halogenlicht, nicht fluoreszierendes Licht, zum Schutz von Phototoxizität Mitochondrien.
- Screen für PA-GFP exprimierenden Zellen mit einer maximal geöffneten Lochkamera und Scannen, um die Zellen, die heller grün zu finden.
- Finden Sie die niedrigsten Macht der 2-Photonen-Laser benötigt, um die PA-GFP aktivieren und optimieren die Bildparameter sicherzustellen, dass das Signal nicht in die Sättigung des Detektors. Sicherstellen, dass die PA-GFP-Signal mit dem TMRE Signal für ein paar Z-Serie kolokalisiert. Der Verlust des TMRE Signal zeigt an mitochondrialen Depolarisation oder Phototoxizität, und Zellen, die eine diese Eigenschaften sollten nicht für die Analyse verwendet werden.
- Finden Sie eine PA-GFP exprimierenden Zelle und geben Sie einen Zoom-Faktor.
- Stellen Sie die Z-Serie Bereich bis 6 Scheiben (dieser Bereich benötigen, um alle 10 Zellen zu befriedigen, wenn ein eigenes z-Fokus an jeder Position gesetzt ist) zu sammeln.
- Speichern der Bildgebungsverfahren für jede Zelle (Zelle 1, Zelle 2 usw.).
4. Passen Sie die Automated Teil des Programms und benennt die 10 Zellen, die Sie für die 1 Stunde Mitochondriale Fusion Assay folgen wird
- Auf der linken Seite des MultiTime Wählen Sie im Fenster "Speichern"-Panel, und geben Sie den Ort, wo Dateien gespeichert werden sollen.
- In der "Übernahme"-Panel, laden Sie die Erwerbsmethode für Zelle 1 in der Scan-Konfiguration gespeichert und überprüfen Sie die Z-Stapel-Box. Auch die Option "gekennzeichneten Z-Mitte z-Stapel".
- In der "Blöcke" Systemsteuerung, wählen Sie "Single Block an jedem Standort". Klicken Sie auf "Add Blöcke" für jedes Intervall gemessen werden soll.
- In der "Timing"-Panel, wählen Sie "warten Intervall" und geben Sie "0" in der "Wartezeit einhalten, bevor er auf den ersten Block Lage nur." Die Blöcke 2-4 wird "15 Minuten" in diesem Abschnitt.
- In der Lage-Panel, wählen Sie "Verschieben des Fokus auf Position zwischen den Standorten zu laden" und "Last Config oder zu scannen, wenn Sie auf 'Weiter loc' geklickt 'to loc bewegen". Unter dem "edit Standorten Liste" wählen Sie "Alle löschen" und wählen Sie dann "multiple Standorten Motortisch ".
- UndER der "Bleach"-Panel, klicken Sie auf die "Bleiche" ein, und benennen Sie die Konfigurationsdatei in der "config" im Pulldown-Menü, wie in dem Fenster der Haupt-Software bezeichnet. Dann, in der "Bleichen" Fenster, speichern Sie die entsprechende Methode Photoaktivierung. In den Regionen Panel, wählen Sie den ROI für diese spezielle Zelle, und stell 'das ROI der MultiTime durch Auswahl von "Add die Region auf die ROI-Liste"-Fenster. Achten Sie darauf, um die gleiche Stelle in der "ROI" wählen Sie im Pulldown-Menü.
Für das Timing richtig funktioniert und für jede Zelle, um eine 15 Minuten-Intervall haben, müssen zwei Methoden, um gerettet zu werden. In der Liste der Blöcke, wird der erste, der die "echte" Photoaktivierung Konfiguration, und der Rest wird eine "Mock"-Konfiguration, die nicht nutzt die Zwei-Photonen-Laser haben. Der erste Block wird auch der einzige Block, der nicht über eine Verzögerung (BKIntv = 0) sein. Daher beginnt das Verfahren mit einer Baseline-Scan, mit einem Photoaktivierung Scan folgt. Der Rest der Blöcke haben eine 900 sec BkIntv, undzu jedem Zeitpunkt gibt es zwei Scans wie zum Zeitpunkt 0 s, um das Timing Konsistenz zu erhalten.
- Für jede der 10 Zellen im Laufe der Zeit verfolgt werden, führen diese Reihenfolge:
Finden Sie eine paGFP-exprimierende Zelle speichern ihre bildgebenden Verfahren
Location-Panel markieren die Position der Bühne, geben bildgebende Verfahren
Haupt-ROI-Panel wählen Sie eine Region von Interesse sein photoaktivierte Bleach-Panel sparen spezifische ROI und laden Sie es auch in der ROI-Box:
Löschen Sie den ROI und setzen Sie den Scan-Zoom bis 1
Finden Sie die nächste Zelle und stellen Sie den Zoom
Wiederholen Sie den Vorgang für die nächsten 9 Zellen
Überprüfen Sie, dass jede Stufe Lage und alle Blöcke die entsprechende bildgebende Verfahren (Scan-Konfiguration) zugeordnet ist. Achten Sie außerdem darauf, dass der erste Block an jedem Ort auf die entsprechende Photoaktivierung Methode entspricht, während der Rest einen "Mock"-Methode enthalten. Schließlich wählen Sie "Ausführen".
5. Analysieren Sie die PA-GFP-Signal Intensity
- Dann exportieren Sie die Daten nach Excel und berechnen die durchschnittliche Intensität für Z-Stapel zu jedem Zeitpunkt. Entsorgen optische Schnitte, die kein Signal haben.
- Messen Sie das Signal Verdünnung in jedem Z-Stapel durch Berechnung des Prozentsatzes der ursprünglichen photoaktivierte Signal.
Jeder Datenpunkt abgetastet und aufgezeichnet zweimal, wodurch der doppelte Z-Stapel-Informationen für jeden Zeitpunkt. Prüfen, ob die Z-Stapel-Werte stimmen. Wenn nicht, ist dies für ein Problem (zB Fokus-, Zell-Bewegung).
6. Repräsentative Ergebnisse
Wenn ein Ereignis Fusionsprotein zwischen einem aktivierten und nicht aktivierten PA-GFP Mitochondrium auftritt, mischt sich das paGFP in der mitochondrialen Matrix mit dem nicht-markierten Matrix und wird verdünnt über einen größeren Bereich, verringert das SignalIntensität (Abbildung 1A). In der Zelle INS1, tritt eine signifikante Abnahme der Signalintensität alle 15 Minuten, bis Äquilibrierung der mitochondrialen Fusion erreicht ist (etwa 1 Stunde). Beachten Sie, dass die Zelle in 1B nahezu vollständige Co-Lokalisation von PA-GFP und TMRE Signale aufweist. In diesen Tests eine sehr niedrige Konzentration von TMRE (15 nm) wird verwendet, um gezielt helfen, die Photoaktivierung von paGFP, und auch zu Zelle Gesundheit zu überwachen. Zellen mit einer Fülle von depolarisiert Mitochondrien haben unvollständige Kolokalisation von paGFP und TMRE und sollte nicht analysiert werden, da dies zeigt entweder Phototoxizität, oder Zellen in einem sterbenden Staat.
Die Äquilibrierung für mitochondriale Fusion ist in der Regel für 1 Stunde in INS1 Zellen, wenn etwa 15% des mitochondrialen Volume aktiviert. Manchmal, auch wenn ein kleiner Bereich beleuchtet wird, werden die meisten Mitochondrien photoaktiviert aufgrund wobei stark vernetzt, wobei weitere Fusion ist schwer zu erkennen. Andere Zelltypen weisen unterschiedliche Zeiten für die Gleichgewichtseinstellung und sollten in kürzeren Abständen und über einen längeren Zeitraum getestet werden, um mitochondriale Dynamik zu charakterisieren. Um mitochondrialen Fusion inhibieren, können Zellen aus dem lipotoxische angeordnet zu werden. Es wurde zuvor gezeigt, dass 0,4 mM Fragmente Mitochondrien-Palmitat, und hemmt mitochondrialen Fusion 9. Dieser Effekt kann in 2, wo Mitochondrien führen gesehen werden, aber die Signalintensität des mtPAGFP nicht so viel wie unter normalen Bedingungen ändern (1). Daher ist die Verdünnung des PA-GFP-Signal dürfte darauf zurückzuführen sein, mitochondriale Fusion statt Kernspaltung. In anderen Zelltypen, empfehlen wir die Verwendung von anderen bekannten Möglichkeiten, um mitochondriale Fragmentierung induzieren, wie zum Schweigen OPA1, die für mitochondriale Fusion 14 ist.
Abbildung 1. A. PA-GFP wird zunehmend dunkler durch mitochondriale Fusion Ereignisse, die zur Verdünnung des Proteins über eine zunehmende Fläche, wie in diesen projizierten Bildern zu sehen ist von 6 optische Schnitte alle 15 Minuten quantifiziert. B. TMRE mit PA-GFP zeigt, dass die Mitochondrien aktiv und nicht depolarisiert sind. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. Mitochondriale Fusion mit 0,4 mM Palmitat gehemmt verringert die Verdünnung des PA-GFP. A. Projektionen von 6 optische Schnitte zeigen kurze Mitochondrien mit einer unveränderlichen Signalintensität über die Zeit. B. Kolokalisation von PA-GFP mit TMRE zeigt, dass die Mitochondrien sind nicht depolarisiert. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .
Discussion
Dieses Verfahren ermöglicht die Abbildung von etwa 10 Zellen zu einem Zeitpunkt, wenn die Beschaffung tritt alle 15 Minuten nach der Photoaktivierung. Die genaue Anzahl der Zellen wird davon abhängen, wie schnell man in der Lage zu lokalisieren und markieren Sie die mtPAGFP exprimierenden Zellen in der Kulturschale, und wie schnell kann man einrichten alle Software-Parameter ist. Um die Automatisierung reibungslos eine gleichmäßige Schicht von Zellen zu verwenden, weil die benannten Z-Stapel-Margen für alle Zellen anwenden wird.
Die Größe dieses ersten Photoaktivierung Bereich regeln die Wartezeit. Um mitochondrialen Fusion messen, ist es wichtig, dass nur 10-20% des Netzes, so dass die Ausbreitung des Signals mit dem Rest des Netzes über die Zeit überwacht werden kann photoaktivieren. Wenn zu viel des Netzes wird photoaktiviert, ist es möglich, dass eine vollständige Fusion zu schnell kommen, und das Ereignis wird nicht erfasst werden.
Äußerste Sorgfalt muss darauf geachtet werdenEinstellung der Laserleistung von der Zwei-Photonen-Laser sowie die Konzentration auf TMRE Phototoxizität die mitochondriale Depolarisation führt zu vermeiden. Sicherstellen, dass das Signal mit dem mtPAGFP TMRE Signal kolokalisiert kann bei der Beurteilung der Phototoxizität und allgemeine Gesundheit Zelle 8,15 zu helfen. Beleuchtung mit Licht epifluoerescent sollte vermieden werden. Auf der Suche nach Zellen, die mtPAGFP, sollte das Loch sein, maximal geöffneten beim Scannen mit einem Low-Power 488nm Anregung. Einstellen der Zwei-Photonen-Laser-Leistung zu photoaktivieren genug PA-GFP, um das Signal über 1 Stunde messen, aber nicht zu übersättigen eine der Zellen kann tückisch sein 8. Allerdings Mal in diesem Schritt der Optimierung ausgegeben werden sollte, denn wenn automatisiertes Programm gestartet wird, ist es mühsam, ihn zu stoppen, um mehr Zellen zu wählen, und wieder aufzunehmen.
Für die Qualitätskontrolle, Akquisition eines Differential Interferenz Kontrast (DIC) Bild (oder Durchlicht), um den Fokus auf die Zellen überwachen kann sehr seinhilfreich und auch ein guter Weg, um Luftblasen im Immersionsöl während des Scannens gebildet zu erkennen; dies geschieht manchmal aus den Bewegungen der Bühne.
Obwohl mit diesen Verfahren mtPAGFP sammelt Daten über die unidirektionale Bewegung der mitochondrialen Matrix Proteine aus photoaktiviert Mitochondrien diejenigen, die nicht markiert sind, ist es denkbar, diese Technik auf andere Prozesse zu studieren nutzen. Zum Beispiel können bestimmte Fluorochrome, Membranproteine angebracht werden, um ihre spezifischen Bewegung während der Fusion Ereignisse zu beobachten, wie es für ABC-me, die Fusion von denen auf einer anderen Zeitskala aus dem Mischen von löslichen Matrixproteine 15 tritt gezeigt worden.
Disclosures
Produktion und freien Zugang zu diesem Artikel wird von Zeiss, Inc. gesponsert
Acknowledgments
Wir danken der Tufts Center for Neuroscience Research, P30 NS047243 (Jackson), die Mitochondrien Affinity Forschung Sonderforschungsbereich (mtARC) durch die Evans Zentrum für interdisziplinäre biomedizinische Forschung an der Boston University Medical Campus, Link Medicine Corporation unterstützt, und Zeiss für die Unterstützung dieser Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COXIII-adenoviral PA-GFP | Dr. Lippincott-Schwartz | ||
| TMRE | Invitrogen | T669 | |
| Zeiss LSM 710 confocal | Carl Zeiss, Inc. |
References
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