Summary
Este protocolo describe la estimulación de los fibroblastos cultivados con ultrasonido pulsado de baja intensidad, que impulsa la formación de adherencias de coordinación y activación de Rac1 imitando la participación de los receptores transmembrana de la matriz, sindecano-4. Este enfoque permite la investigación de una técnica exitosa clínica en el nivel celular, proporcionando oportunidades para el perfeccionamiento de la terapia.
Abstract
En los organismos multicelulares, comportamiento de la célula está dictado por las interacciones con la matriz extracelular. Consecuencias de la amplia participación de la matriz de la regulación de la migración y la proliferación celular, la secreción e incluso la diferenciación. Las señales que subyacen a cada uno de estos procesos complejos surgen de las interacciones moleculares de los receptores de la matriz extracelular en la superficie de la célula. Las integrinas son los receptores prototípicos y proporcionar un enlace mecánico entre la matriz extracelular y el citoesqueleto, así como algunos de iniciar la cascada de la adhesión dependiente de señalización. Sin embargo, cada vez es más evidente que los receptores adicionales transmembrana funcionar junto a las integrinas para regular tanto la misma integrina y las señales de corriente abajo. El más elegante de estos ejemplos es el proteoglicano transmembrana, sindecano-4, que coopera con α 5 β 1-integrina en la adhesión a la fibronectina. En modelos in vivo demonstrcomió la importancia de sindecano-4 de señalización, como sindecano-4-knock-out ratones muestran retraso de curación debido a la migración de los fibroblastos 1,2 ineficaz. En animales de tipo salvaje, la migración de los fibroblastos hacia una herida se desencadena por la aparición de la fibronectina que las fugas de los capilares dañados y se deposita por los macrófagos en el tejido lesionado. Por lo tanto existe un gran interés en el descubrimiento de estrategias que mejoren la señalización dependiente de la fibronectina y podría acelerar los procesos de reparación.
Los componentes de la integrina mediadas y sindecano-4-mediada de fibronectina-dependientes de señalización pueden ser separados por las células estimulantes con fragmentos de fibronectina recombinantes. Aunque el compromiso de la integrina es esencial para la adhesión celular, ciertas señales de fibronectina-dependientes están regulados por sindecano-4. Sindecano-4 activa la señal de Rac1 protrusiva 3, hace que la redistribución de la integrina 1, factores desencadenantes de contratación de las moléculas del citoesqueleto, como vinculina, al centro de coordinaciónadherencias 4, y por lo tanto induce la migración direccional de 3. Hemos buscado estrategias alternativas para la activación de dichas señales y se encontró que de baja intensidad de ultrasonido pulsado (lúpicos) puede imitar los efectos de la participación sindecano-4 5. En este protocolo se describe el método por el que 30 mW / cm 2, 1,5 ultrasonido MHz, pulsados a 1 kHz (fig. 1) se puede aplicar a los fibroblastos en cultivo (Fig. 2) para inducir la activación y la formación de Rac1 adhesión focal. Estimulación ultrasonido se aplica durante un máximo de 20 minutos, ya que esta combinación de parámetros se ha encontrado que sea más eficaz para la aceleración de la reparación de fracturas clínica 6. El método utiliza fragmentos recombinantes fibronectina a participar α 5 β 1-integrina, sin compromiso de sindecano-4, y requiere la inhibición de la síntesis de proteínas por cicloheximida para bloquear la deposición de matriz adicional por los fibroblastos., El efecto positivo oecografía f en los mecanismos de reparación está bien documentado 7,8, y por entender el efecto molecular de la ecografía en la cultura que debe ser capaz de perfeccionar la técnica terapéutica para mejorar los resultados clínicos.
Protocol
1. Recubrimiento de superficies con el ligando Matrix
- El ultrasonido se aplica a las células en 3,5 cm de pozos, ya sea como platos individuales o como una placa de 6 pocillos. Para los ensayos bioquímicos, abrigo ligando directamente sobre el plástico. Por inmunofluorescencia, vidrio ebullición cubreobjetos tres veces en agua MilliQ y el lugar 4 cubreobjetos en la parte inferior de cada pocillo.
- Las superficies de cristal debe ser derivatizada para asegurar el revestimiento ligando eficiente. Disolver sulfo-m-maleimidobenzoil-N-hydrosuccinimide éster en PBS a 1 mM. Añadir 2 ml a cada pocillo y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar las superficies derivatizadas 3 veces con PBS.
- Capa ya sea de vidrio o plástico derivatizado no tratada con el ligando de la integrina. Aplicar 2 ml de 10 ug / ml integrina ligand9, se disolvió en PBS que contenía Ca 2 + y Mg 2 + a cada pocillo e incubar durante la noche a 4 ° C.
- Preparar monoparticulate BSA por calentamiento de 1% de BSA, se disolvió en PBS, a 85 ° C durante 13 minutos. Permitirpara enfriar y luego pasan a través de un filtro de 0,45-micras.
- Lavar ligando superficies recubiertas 3 veces con PBS y se bloquea con la BSA monoparticulate durante 30 minutos.
2. Preparación de las células
- Para controlar el entorno matriz durante todo el experimento, la síntesis de proteínas debe ser bloqueado por la adición de 25 mg / ml de cicloheximida a 80% confluentes de fibroblastos durante 2 horas.
- Lavar las células tratadas con cicloheximida-con PBS y desprenderse del frasco de cultivo utilizando 0,5 mg / ml de tripsina / EDTA.
- Cosecha individual células por centrifugación a 500x g durante 5 minutos.
- Resuspender las células en DMEM/25 mM HEPES, 25 microgramos / ml de cicloheximida.
- Contar densidad celular de la suspensión usando un hemocitómetro y se diluye a 105 ml-1.
- Se incuban las células a 37 ° C durante 20 minutos para recuperar la integrina superficie.
- Lavar las ligando recubierto, BSA-bloqueados pocillos 3 veces con PBS.
- Semillas 2 ml de la suspensión de células en cada pocillo.
- Allocélulas w para difundir durante 2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2.
3. Ultrasonido Estimulación
- Caliente el conjunto emisor de ultrasonidos y el gel de acoplamiento a 37 ° C.
- Aplique una gota del tamaño de una arveja de acoplamiento en gel para cada emisor.
- Prueba de que cada emisor es funcional con un indicador de ultrasonido detector de diodo.
- Coloque los pozos en la matriz del emisor. Volver matriz a 37 ° C, 5% de CO 2 y la temperatura hasta que se estabilice durante 10 minutos.
- Conectar la señal de ultrasonido.
- La señal de ultrasonido se desactiva después de 20 minutos, imitando el régimen terapéutico. Si tiempos más cortos de estimulación se requieren, las planchas deben ser retirados de la matriz en el momento apropiado puntos. En todos los casos utilizar placas no estimulada como control negativo.
4. Análisis de adhesión focal por inmunofluorescencia
- Para el análisis de la formación de adhesión focal, aplicar la señal de ultrasonido 20-minutoy luego permitir que las estructuras para desarrollar durante otros 40 minutos, manteniendo las células a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Aspirar medios y fijar las células mediante la aplicación de 2 ml de paraformaldehído al 4% en PBS. Incubar durante 14 minutos a temperatura ambiente.
- Aspirar paraformaldehído y enjuagar tres veces con PBS, aplicando el SBP suavemente por el borde del pozo para evitar la generación de fuerzas de cizallamiento.
- Transfiera cada cubreobjetos de los 3,5 cm y una placa de 24 pocillos para la tinción de inmunofluorescencia posterior.
- Quench paraformaldehído residual mediante la aplicación de 0,5 ml de glicina 0,1 M en PBS a cada uno de los 24 pozos. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Aspirar glicina y enjuagar tres veces con PBS.
- Permeabilizar las células mediante la aplicación de 0,5 ml de 0,5% de Triton X-100 (w / v) en PBS. Incubar durante 4 minutos a temperatura ambiente.
- Aspirar Triton X-100 y enjuagar tres veces con PBS.
- Bloque aplicando 0,5 ml de 3% (w / v) de BSA en PBS. Incubar toda la noche a 4 + Dpor ejemplo, C.
- Teñir vinculina que contienen la adhesión focal con hVIN-1 anticuerpo diluido 1:400 en el bloque de BSA. Incubar durante una hora a temperatura ambiente.
- Enjuague tres veces con PBS.
- Aplicar fluoróforo (DyLight 488)-anticuerpo secundario conjugado (diluido 1:200) y actina mancha con TRITC conjugado phalloidin (diluido 1:200) en el bloque de BSA. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Enjuagar tres veces con PBS, y una vez con agua.
- Montar en un portaobjetos de vidrio en posición invertida utilizando Prolongue medio de montaje de oro.
5. La cuantificación de Rac1 Activación por Pull-down de ensayo
- Para el análisis de activación Rac1, aplicar la señal de ultrasonido 20-minuto a las células a 37 ° C, 5% de CO 2. Al evaluar los tiempos de respuesta más largos de 20 minutos, aplicar la señal de ultrasonido durante 20 minutos y mantener las células a 37 ° C, 5% de CO 2 para el tiempo restante para permitir que la respuesta a desarrollar.
- Aspirar los medios de comunicación y el lugar, asís en hielo. Lavar los pocillos con 2 ml de PBS frío y aspirado. Asegurarse de cualquier residuo de PBS se retira dejando pozos inclinados durante 1 minuto seguido de aspiración completa.
- Lisar las células en hielo con 35 l de tampón de lisis (10% de glicerol, 20 mM Hepes pH 7,4, 140 mM de NaCl, 1% de NP40, 0,5% de desoxicolato de sodio, 4 mM EGTA, 4 mM de EDTA, 1 x inhibidor de la proteasa completa) por pocillo. En este ejemplo, 6 pocillos se utilizan por punto de tiempo para generar l de lisado de células 210. Pozos más o menos se puede utilizar pero el volumen de lisado total debe sumar 200 ~ l.
- Células Raspe cuidadosamente con un raspador de células para asegurar la lisis celular completo y dejar los pozos inclinados durante 1 minuto para permitir lisado a la piscina.
- Transferir a un lisado enfriado con hielo 1,5 ml tubo de microcentrífuga (lisados puesta en común de régimen mismo tratamiento) y centrifugado a 21.000 xg durante 2 minutos a 4 ° C para sedimentar los residuos celulares.
- Transferencia de 180 l de lisado de helado de 1,5 ml que contienen tubos de microcentrífuga 130 l de tampón de lisis y 25 l exceso de PAK-athione agarosa 10. Mantener lisado bruto restante a -20 ° C para la separación de gel posterior.
- Captura Rac1 activa en las perlas PAK-glutatión agarosa al girar los tubos durante 40 minutos a 4 ° C.
- Cosecha de agarosa bolas conjugados por centrifugación a 2000 × g durante 1 minuto a 4 ° C.
- Lavado talón conjuga tres veces con 500 l de tampón de lisis, la recolección perlas por centrifugación a 2000x g sobrenadante y desechar después de cada lavado. Retire con cuidado el tampón de lisis de lavado restante con una pipeta de 200 l.
- Eluir cada muestra mediante la adición de 35 l de SDS-PAGE de tampón de carga y se incuba a 85 ° C en un bloque de calor agitando durante 5 minutos. Eliminar cuentas por centrifugación a 21000 × g durante 1 minuto.
- Resolver eluato talón por SDS-PAGE, transferencia a nitrocelulosa y la sonda para Rac1.
6. Los resultados representativos
En este protocolo se describe la inducción de vinculina-manchaed focales adherencias y Rac1 actividad por ultrasonido. Para el experimento de adhesión focal, la posición de referencia es que los fibroblastos se extienden sobre un ligando de α 5 β 1-integrina no forman vinculina contienen adherencias (Fig. 3A) a menos que un segundo receptor de fibronectina, sindecano-4, se acopla mediante la adición de ligando soluble (Fig. 3B) 3,4. Sin embargo, la estimulación con ultrasonido induce la formación de adherencias focal para la misma medida que el compromiso de sindecano-4 (fig. 3C), lo que indica que la estimulación de ultrasonido puede sustituir a ciertos componentes de la vía de señalización fibronectina-dependiente 5. El obstáculo clave con este protocolo es la eliminación de la formación de adhesión focal en ausencia de estimulantes. La inhibición incompleta de la síntesis de proteínas cicloheximida permitirá la deposición de matriz que es suficiente para las células para auto-estimulación. El hacinamiento de las células también pueden conducir a bajo nivel de adhesión focal formation, y una mala respuesta a la ecografía como la diafonía entre célula-célula y célula-matriz de contactos va a complicar un experimento que está diseñado para aislar un solo estímulo. Como desarrollo del ensayo de base se muestra el mismo experimento, repetido con fibroblastos carecen sindecano-4 (fig. 4). Estos fibroblastos todavía responden a la ecografía (Fig. 4C), pero no responden a sindecano-4 ligando (Fig. 4B). El experimento con SDC4 - / - fibroblastos demuestra que el ultrasonido de hecho puede pasar por alto la necesidad de que los receptores de fibronectina determinados, e ilustra cómo el protocolo simple puede ser desarrollado para obtener información adicional acerca de la vía de señalización.
Para el experimento bioquímico se demuestra que el ultrasonido puede inducir la activación de Rac1, utilizando un ensayo de tracción hacia abajo que es una adaptación del método descrito por Del Pozo et al. 10. La precipitación de activo Rac1 0, 10, 30 y 60 minutos después de iniciación de la estimulación de ultrasonido revela que los picos de actividad Rac1 en 10-30 minutos, antes de regresar a la línea de base (Fig. 5). Blotting lisados crudos de vinculina asegura una carga equivalente entre los puntos de tiempo. El resultado se asemeja a la activación de Rac1 por el compromiso de syndecan-4 3, pero es un poco más prolongada que la activación de la fibronectina. Por lo tanto 8-10 repeticiones suelen ser necesarios para lograr datos significativos. La activación de Rac1 es responsable del compromiso de las células para la formación de adhesión focal, y nacientes adhesiones focales empiezan a formar en 10-30 minutos, coincidiendo con la activación de Rac1. Una vez iniciada, esas adherencias seguirá madurar en las grandes placas de adhesión mostrados en las Figuras 3 y 4.
Figura 1. La forma de onda de ultrasonido. El ultrasonido comprende una señal intermitente de 1,5 MHz que, debido a la amplitud baja (30 mW / cm <sup> 2, promedio espacial, el promedio temporal) no tiene efecto de calentamiento.
Figura 2. Representación esquemática del flujo de trabajo para la preparación y estimulación de las células con ultrasonido.
Figura 3. Inducción de Ultrasonido de la formación de adhesión focal en los fibroblastos. Los fibroblastos se extendieron sobre el fragmento de la integrina de unión de la fibronectina (A) antes de la estimulación con el fragmento sindecano-4-unión de la fibronectina (B) o ultrasonido (C). Después de 60 minutos de estimulación, las células se fijaron, se tiñeron de vinculina y actina, y fotografiada por epifluorescencia. Bar = 10 micras.
Figura 4. Ultrasonido de inducción de la formación de adhesión focal en los fibroblastos que carecen de sindecano-4.
Figura 5. La activación de Rac1 por ultrasonido. Las células fueron estimuladas por minuto 0, 10, 30 y 60 con 6 pocillos utilizados por cada punto del tiempo. La cantidad de GTP-Rac1 presentes en las muestras de un Rac1 desplegable evolución en el tiempo de ensayo fue visualizado por incubación con anti-anticuerpos Rac1 en un western blot (imagen superior). La cuantificación de la intensidad de la banda (un promedio de 10.8 repeticiones) revela un incremento de un Rac1ctividad resultante de la señal de ultrasonido a los 10 y 30 minutos, antes de regresar a los niveles basales a los 60 minutos (el gráfico). Las barras de error representan el SEM
Discussion
En este protocolo se describe el método por el cual puede ser un tratamiento que se aplica normalmente a pacientes humanos utilizados en los experimentos basados en células. El objetivo final es comprender el mecanismo molecular de acción de ultrasonido para que la terapia puede ser refinado. En este protocolo, se utiliza fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) como un sistema de células de modelo, pero la ecografía ha sido también ha encontrado que es eficaz en fibroblastos primarios de prepucio humano 5, las células madre mesenquimales, osteoblastos y condrocitos 6. Nuestro método de activación de Rac1 como un ensayo de ejemplo, bioquímica, pero el método puede ser utilizado igualmente para poner a prueba la regulación de la fosforilación de proteínas o la formación de complejos de proteínas por inmunoprecipitación. Para el ejemplo de inmunofluorescencia demostramos una ecografía efecto sobre la formación de adhesión focal, pero la redistribución de cualquier molécula podría ser examinado. Por ejemplo, uno podría poner a prueba la contratación de factores citosólicos a la membrana plasmática, la colocalización de proteins en el tráfico de vesículas o examinar el efecto de los ultrasonidos sobre la organización del huso mitótico. Hasta ahora hemos confinado mismos para probar la fibronectina dependiente de las vías, por el efecto de los ultrasonidos sobre las células en el colágeno, o en presencia de factores de crecimiento podría ser probado para construir una imagen de ultrasonido cómo influye en el comportamiento de la célula en un entorno complejo que más se asemeja mucho a una situación in vivo. Un desafío mayor será para probar el efecto de los ultrasonidos con time-lapse de imágenes, donde la presencia del emisor bloquea la trayectoria de la luz y las vibraciones de los ultrasonidos actuales obstáculos técnicos adicionales. Sin embargo, el hecho de que la aplicación terapéutica requiere sólo 20 minutos de estimulación por día sugiere que el análisis de comportamiento de las células después de una ráfaga de estimulación puede ser productivo.
Disclosures
Andrew Harrison es un empleado de Smith & Nephew Limited del Reino Unido.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por Wellcome Trust de subvención 088.419 de bancos multilaterales de desarrollo y el patrocinio por Smith & Nephew UK Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | Fisher Scientific | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
| 13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| 50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
| DMEM/25 mM HEPES | Sigma-Aldrich | D6171 | |
| Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc. | ||
| Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc. | ||
| SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc. | ||
| hVIN-1 | Sigma-Aldrich | V9264 | |
| DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratagene, Agilent Technologies | 715-485-150 | |
| TRITC-labelled phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
| cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche Group | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
| PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G/0650/17 | |
| Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
| NaCl | Fisher Scientific | S/0160/65 | |
| NP40 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
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