Summary
Bu protokol, fokal adezyon oluşumu ve transmembran reseptör matrisi, syndecan-4 nişan taklit ederek Rac1 aktivasyon sürücüler düşük yoğunlukta kesikli ultrason ile kültüre fibroblast stimülasyonu açıklar. Bu yaklaşım, böylece tedavinin arıtma için fırsatlar sağlayarak, hücresel düzeyde başarılı bir klinik tekniğin soruşturma sağlar.
Abstract
Çok hücreli organizmalarda, hücrenin davranış hücre dışı matriks ile etkileşimi tarafından dikte edilir. Hücre migrasyonu ve proliferasyonu düzenlenmesinden, sekresyon ve hatta farklılaşma matriks-nişan aralığı Sonuçları. Bu, karmaşık işlemlerin her yatan sinyalleri hücrenin yüzeyi üzerinde hücre dışı matris reseptörlerinin moleküler etkileşimin ortaya çıkar. İntegrinler prototipik reseptörleri ve mekanik bir hücre dışı matris ve hücre iskeleti arasındaki bağlantı, hem de yapışma bağımlı bir sinyalleşme cascades bazı başlatıcı sağlamaktır. Ancak, ek transmembran reseptörleri aşağı integrin kendisi ve sinyallerini düzenleyen integrinler yanında çalışmasını giderek daha belirgin hale gelmektedir. Bu örneklerden en zarif fibronektine adezyonu sırasında α 5 β 1-integrin ile işbirliği transmembran proteoglikan, syndecan-4 vardır. In vivo modellerde demonstrsyndecan-4-yoksun farelerde verimsiz fibroblast göçü 1,2 nedeniyle şifa geriliği sergilemek gibi, syndecan-4 sinyal önemini yedik. Vahşi tip hayvanlar, bir yara doğru fibroblastların göçü hasarlı kılcal damarlardan sızıntı ve yaralı dokularda makrofajlar tarafından yatırıldığına dair fibronektin görünümünü tarafından tetiklenir. Bu nedenle fibronektin bağımlı sinyal geliştirmek ve onarım işlemleri hızlandırabilir stratejileri keşfetmek büyük ilgi var.
Fibronektin bağlı sinyal integrin-aracılı ve syndecan-4-aracılı bileşenleri rekombinant fibronektin parçaları ile birlikte uyaran hücreleri tarafından ayrılabilir. Integrin angajman hücre yapışması için gerekli olmasına rağmen, belirli fibronektin-bağımlı sinyallerden syndecan-4 düzenlenir. Syndecan-4 etkinleştirir Rac1 çıkıntılı sinyali 3, fokal integrin dağıtılması 1 gibi vinculin gibi hücre iskeleti moleküllerinin tetikler işe alım, nedenadezyon 4, ve böylece yönsel göçü 3 indüklemektedir. Biz bu sinyalleri aktive etmek için alternatif stratejiler için baktım ve düşük yoğunlukta kesikli ultrason (LIPUS) syndecan-4 nişan 5 etkilerini taklit bulduk. Bu protokolü biz 1 kHz (Şekil 1) darbeli 30 mW / cm 2, 1.5 MHz ultrason, Rac1 aktivasyonu ve fokal adezyon oluşumunu uyarmak için kültür fibroblastlar (Şekil 2) uygulanabilir hangi yöntemi açıklar. Bu parametrelerin kombinasyonu klinik kemik onarımı 6 hızlandırılması için en etkili olduğu tespit edilmiştir olarak ultrason uyarılması, 20 dakikalık bir süre için uygulanır. Yöntemi syndecan-4 angajman olmadan α 5 β 1-integrin, meşgul rekombinant fibronektin parçaları kullanır ve fibroblastlar tarafından ek matriks birikimi engellemek için sikloheksimid protein sentezini inhibe gerektirir., Olumlu etkisi otamir mekanizmaları f ultrason de 7,8 belgelendi, kültür ve ultrason moleküler etkisi anlayarak biz klinik sonuçları iyileştirmek için tedavi tekniği geliştirmek gerekir.
Protocol
1. Matrix Ligand kaplama yüzeyler
- Ultrason bireysel olarak tabaklar veya 6-kuyucuklu plak olarak da, 3,5-cm kuyulara hücreleri için geçerli olacaktır. Doğrudan plastik üzerine biyokimyasal testlerde, ceket ligand. Immünfloresan için kaynatın cam MilliQ su ve her bir kuyunun dibine yerde 4 lamelleri üç kez lamelleri.
- Cam yüzeyleri etkin ligand kaplama sağlamak için türevlendirilmiş olmalıdır. 1 mM PBS içinde sülfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester eritilir. Her oyuğa 2 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
- PBS ile 3 defa türevlendirilmiş yüzeyleri yıkanır.
- Coat ya türevlendirilmiş cam veya integrin bağ ile işlenmemiş plastik. Her oyuğa + ve Mg + 2 Ca 2 içeren PBS içinde çözülmüş 10 ug / ml integrin ligand9 2 ml, uygulanır ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe
- ° C'de 13 dakika süreyle 85 PBS içinde çözülmüş% 1 BSA, ısıtarak BSA monoparticulate hazırlayın. Izin vermeksoğutmak ve daha sonra 0.45 mikron filtre geçmesine.
- 30 dakika boyunca monoparticulate BSA ile ligand-kaplı yüzeylerde ve blok PBS ile 3 kez yıka.
2. Hücreler hazırlanması
- Deney boyunca matris ortamı kontrol etmek için, protein sentezi 25 ug / ml sikloheksimid ila% 80 2 saat boyunca konfluent fibroblastlann ilavesi ile bloke edilmesi gerekir.
- PBS ile sikloheksimid tedavi edilen hücreler durulayın ve 0.5 mg / ml tripsin / EDTA kullanılarak kültür şişelerinde terketmez.
- 5 dakika boyunca 500 kat g'de santrifüj ile hasat müstakil hücreleri.
- DMEM/25 mM HEPES içinde Pastör pipetiyle hücreler, 25 ug / ml sikloheksimid.
- Bir haemocytometer kullanarak süspansiyon hücre yoğunluğu sayın ve 105 ml-1 ye tamamlanır.
- Yüzey integrin kurtarmak için 20 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe hücreleri.
- PBS ile ligand kaplı, BSA ile bloke kuyuları 3 kere yıkayın.
- Her oyuğuna hücre süspansiyonu tohumu 2 ml.
- Allo37 de 2 saat boyunca yaymak için w hücreleri ° C'de,% 5 CO2.
3. Ultrason Stimülasyon
- 37 ° C'ye ultrason verici dizi ve kaplin jel Isınma
- Her emitör için jel kaplin bir bezelye büyüklüğünde damla uygulayın.
- Her verici bir ultrason göstergesi diyot detektör kullanarak işlevsel olduğunu test edin.
- Emetör dizi kuyular yerleştirin. 37 üzere bir dizi dönmek ° C'de, 10 dakika boyunca dengelemek için% 5 CO2 ve izin sıcaklığına.
- Ultrason sinyal açın.
- Ultrason sinyal terapötik rejiminin taklit eden, 20 dakika sonra devre dışı kalır. Kısa stimülasyon kez gerekiyorsa, tabak zaman noktaları, uygun bir dizi çıkarılmalıdır. Tüm durumlarda kullanmak negatif kontrol olarak plakalar unstimulated.
4. İmmünofloresan tarafından Odak Yapışma Analizi
- Fokal adezyon analizi için, 20 dakikalık ultrason sinyali uygulamakve daha sonra yapı ° C'de,% 5 CO2 37 hücreleri tarafından muhafaza daha ileri bir 40 dakika daha geliştirmek için olanak sağlar.
- Medya aspire ve PBS ile 2 ml% 4 paraformaldehit uygulayarak hücreleri düzeltin. Oda sıcaklığında 14 dakika süreyle inkübe edilir.
- Paraformaldehit aspire ve kesme kuvvetlerinin oluşumunu engellemek Kuyunun kenarına yavaşça aşağı PBS uygulayarak, üç kere PBS ile yıkayın.
- 3.5 cm de sonraki immünofloresan boyama için 24-iyi levhaya her coverslip aktarın.
- 24 kuyu herbirine 0.5 ml PBS içerisinde 0.1 M glisin uygulanarak kalıntı paraformaldehit Quench. Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle inkübe edilir.
- Aspirat glisin ve PBS ile üç kere durulanır.
- 0.5 ml% 0.5 Triton X-PBS içinde 100 (w / v) uygulamak suretiyle hücrelerin Permeabilise. Oda sıcaklığında 4 saat boyunca inkübe.
- Aspirat Triton X-100 ve PBS ile üç kere durulanır.
- 0.5 ml% 3 (w / v) PBS içinde BSA uygulanarak bloke eder. 4 & d gece inkübeörneğin; C.
- Leke vinculin-BSA ihtiva eden blok içinde 1:400 seyreltilmiş hVIN-1 antikoru ile fokal yapışması. Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edilir.
- PBS ile üç kere durulanır.
- Fluorofor (DyLight 488)-konjuge sekonder antikor (1:200 seyreltilmiş) ve BSA blok TRITC-konjuge Phalloidin (1:200 seyreltilmiş) ile leke aktin uygulayın. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
- PBS ve bir kez su ile üç kere durulanır.
- Altın mountant Prolong kullanarak ters konumda bir cam slayt üzerine monte edin.
5.. Pull-down Tahlil tarafından Rac1 Aktivasyon Kantitasyonu
- Rac1 aktivasyon analizi için, 37 hücreleri için 20 dakikalık bir ultrason sinyali uygulamak ° C'de,% 5 CO2. 20 dakikadan daha uzun bir tepki süresi değerlendirilirken, 20 dakika için ultrason sinyal uygulanır ve 37 ° C'de muhafaza hücreleri,% 5 yanıtı geliştirmek için izin vermek üzere geri kalan süre CO 2.
- Aspirat medya ve yerini iyibuz üzerinde s. 2 ml soğuk PBS ve aspirat ile kuyu durulayın. Sağlanması herhangi bir rezidüel PBS ayrıntılı aspirasyon ardından 1 dakika boyunca hareket ettirildiğinde kuyu bırakarak ile uzaklaştırılır.
- Oyuk başına 35 ul lizis tamponu (% 10 gliserol, 20 mM Hepes pH 7.4, 140 mM NaCl,% 1 NP40,% 0.5 sodyum deoksikolat, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 × tam proteaz inhibitörü) ile buz üzerinde hücreleri Lyse. Bu örnekte, 6 kuyu hücre lizatı 210 ul üretmek için bir zaman noktası başına kullanılır. Daha fazla veya daha az kuyu kullanılabilir ancak toplam lizat hacmi toplam gerektiğini ~ 200 ul.
- Hücre kazıyıcı ile iyice Pençe hücrelerin tam hücre parçalama sağlamak ve kuyular terk havuzuna lizat izin vermek için 1 dakika yatırılabilir.
- Pelet hücresel enkaz 4 ° C'de 2 dakika 21000 bir buz 1.5 ml mikrofuge'de tüp (aynı tedavi rejimi havuzu lizatları) ve spin × g Lizat aktarın.
- Lizis tampon 130 ul ile 25 ul PAK-glut içeren 1.5 ml mikrofuge'de tüpler buz soğuk lizatın 180 ul transferathione agaroz boncuk 10. Sonraki jel ayrılması için -20 ° C'de kalan ham lizat tutun.
- 4 azından 40 dakika süreyle tüpler döndürerek PAK-glutation agaroz boncukları aktif Rac1 yakalamak ° C.
- Hasat agaroz boncuk 2000 santrifüj ile konjugatlarda × g 1 dakika boyunca 4 ° C'de
- Yıkama boncuk, her yıkamadan sonra 2000x g atarak süpernatan santrifüj ile boncuk hasat, 500 ul lizis tamponu ile üç kez konjugatlarda. Dikkatli bir şekilde 200 ul pipet yardımıyla kalan lizis yıkama tamponu çıkarın.
- 5 dakika için bir titreme ısı blok üzerinde 85 ile 35 ul SDS-PAGE yükleme tamponu ve inkübe ° C ekleyerek her bir örnek Zehir. 1 dakika için 21000 × g de santrifüj boncuk çıkarın.
- SDS-PAGE ile boncuk eluat çözümleme, Rac1 için nitroselüloz ve prob transfer.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Bu protokolü biz vinculin-leke indüksiyon tarifed odak yapışıklıklar ve ultrason ile Rac1 aktivite. Fokal adezyon deney için, başlangıç pozisyonu α 5 β 1-integrin bir ligand yayılmış fibroblastlar ikinci bir fibronektin reseptörü, syndecan-4, sürece vinculin içeren yapışıklıklar (Şekil 3A) oluşturmak kalmamasıdır ilavesi ile uğraşan Çözünür ligandı (Şekil 3B) 3,4. Bununla birlikte, ultrason ile stimülasyon olduğunu ultrason stimülasyon fibronektin bağımlı sinyal yolağı 5 belirli bileşenleri yerini alabilir gösteren syndecan-4 (Şekil 3C) katılımını aynı ölçüde fokal adezyon oluşumunu indükler. Bu protokol ile önemli bir engeli uyarıcı olmaksızın fokal adezyon oluşumunu yok ediyor. Sikloheksimid protein sentezinin inhibisyonu Eksik otomatik uyarmak için hücreleri için yeterlidir matriks birikimi sağlayacaktır. Hücrelerinin aşırı kalabalık da düşük seviyeli fokal yapışma oluşumunu bir yol açabilirn ve hücre-hücre ve hücre-matriks kişiler arasında çapraz olarak ultrason yanıtı zayıf, tek bir uyarıcı izole etmek için tasarlanmış bir deney zorlaştıracaktır. Temel analiz bir gelişme olarak biz syndecan-4 (Şekil 4) eksik fibroblastlar ile tekrar aynı deneyi, göstermektedir. Bu fibroblastlar hala ultrason (Şekil 4C) yanıt, ama syndecan-4 ligand (Şekil 4B) yanıt vermek için başarısız. - / - Sdc4 kullanarak deney fibroblastlar bu ultrason aslında belirli fibronektin reseptörleri için ihtiyaç atlayabilir gösterir ve basit bir protokol sinyal yolu hakkındaki ek bilgileri elde etmek için nasıl geliştirilebilir göstermektedir.
Biyokimyasal deney için biz ultrason Del Pozo ve ark. 10 tarafından anlatılan yöntemin bir adaptasyon olan bir açılan testi kullanılarak, Rac1 aktivasyonuna neden olabilir göstermektedir. Aktif Rac1 0, 10, 30 ve ini sonra 60 dakika Yağışultrason stimülasyon tiation temel (Şekil 5) dönmeden önce, 10-30 dakika Rac1 aktivite pik ortaya koymaktadır. Vinculin için ham lizatları Blotting zaman noktaları arasındaki eşdeğer yükleme sağlar. Sonuç syndecan-4 3 nişan tarafından Rac1 aktivasyonu benzer, ancak fibronektin tarafından aktivasyon biraz daha uzun süreli olduğunu. Bu nedenle 8-10 tekrarlar genellikle önemli veri elde edilmesi için gereklidir. Rac1 aktivasyonu fokal adezyon oluşumuna hücrelerin bağlılık sorumludur ve doğmakta olan fokal adezyon Rac1 aktivasyonu ile örtüşen, 10-30 dakika oluşturmaya başlar. Bir kez başlatılan, bu adezyon Şekil 3 ve 4'te gösterildiği gibi, büyük yapışma plaklar içine olgun devam edecektir.
Şekil 1. Ultrason dalga formu. Ultrason aralıklı 1,5 MHz sinyali oluşur düşük genlikli (30 mW / cm <nedeniyle> 2 sup, mekansal ortalama, zamansal ortalama) hiçbir ısıtma etkisi vardır.
Şekil 2. Hazırlanması ve ultrason ile hücrelerin uyarılması için iş akışı şematik gösterimi.
Şekil 3. Fibroblastlarda fokal adezyon Ultrason indüksiyon. Fibroblastların syndecan-4-bağlayıcı fibronektin fragmanı (B) veya ultrason (C) stimülasyon önce fibronektin integrin bağlayıcı parçası (A) üzerine yayıldı. 60 dakikalık uyarının ardından, hücreler tespit edildi vinculin ve aktin için boyanıp Epifloresans tarafından görüntülendi. Bar = 10 mikron.
Şekil 4. Syndecan-4 yoksun fibroblastlar fokal adezyon Ultrason indüksiyon.
Şekil 5. Ultrason ile Rac1 aktivasyonu. Hücreler zaman noktası başına kullanılan 6 kuyuları olan 0, 10, 30 ve 60 dakika süreyle uyarıldı. Bir Rac1 açılan testi zaman dersten örneklerinde GTP-Rac1 mevcut miktarı bir western blot (üstteki resim) anti-Rac1 antikor ile inkübasyon tarafından görüntülendi. Bant yoğunluğu (8-10 ortalama nüsha) Kantitasyonu Rac1 bir artış ortaya koymaktadırctivity 60 dakika (grafik) de taban seviyelere dönmeden önce, 10 ve 30 dakika ultrason sinyal kaynaklanan. Hata çubukları sem temsil
Discussion
Bu protokolde, normalde insan hastalara uygulanan bir tedaviye hücresi bazlı Deneylerde kullanılan edilmesini sağlayacak yöntemi açıklanmaktadır. Nihai hedefi tedavisi rafine böylece ultrason eylem moleküler mekanizması anlamaktır. Bu protokol, biz bir model hücre sistemi olarak fare embriyonik fibroblast (MEFS) kullanır, ancak ultrason da birincil insan sünnet derisi fibroblastlarında 5, mezenkimal kök hücre, osteoblast ve kondrosit 6 etkili olduğu tespit edilmiştir edilmiştir. Bir örnek olarak test biyokimyasal Rac1 aktivasyon kullanan, ancak aynı derecede protein yöntemi fosforilasyon ya immünopresipitasyon protein kompleksleri oluşumu düzenlemesi test etmek için kullanılabilir. Immünofloresan Örneğin biz fokal adezyon oluşumu üzerine etkisi ultrason gösteren, ancak herhangi bir molekül dağılımının yeniden incelenebilir. Örneğin, bir prote arasında colocalisation, plazma zarına sitosolik faktörlerin alım test edebilirkaçakçılığı veziküllerde bileşenlerini veya mitotik iğ organizasyon ultrason etkilerini incelemek. Şimdiye kadar kendimizi kollajen üzerine, ya da büyüme faktörleri varlığında ultrason karmaşık bir ortamda hücre davranışlarını nasıl etkilediği konusunda bir resim oluşturmak için test edilebilir hücreleri üzerinde ultrason etkisi ile, fibronektin-bağımlı yolların test sınırlı olduğunu daha yakından bir in vivo durum benzer. Daha büyük bir zorluk verici varlığı ultrason Mevcut ek teknik engeller ışık yolu ve titreşim engelleme time-lapse görüntüleme, ultrason kullanarak etkisini test etmek olacaktır. Ancak, tedavi uygulaması günlük stimülasyon sadece 20 dakika gerektirdiği gerçeğine stimülasyon bir patlama sonrası hücre davranışı o analizi de verimli olabileceğini düşündürmektedir.
Disclosures
Andrew Harrison Smith & Nephew Birleşik Krallık Sınırlı bir çalışanıdır.
Acknowledgments
Bu çalışma, Smith & Nephew Birleşik Krallık Ltd MDB ve sponsorluk için Wellcome Trust hibe 088.419 tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | Fisher Scientific | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
| 13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| 50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11. Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
| DMEM/25 mM HEPES | Sigma-Aldrich | D6171 | |
| Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc. | ||
| Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc. | ||
| SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc. | ||
| hVIN-1 | Sigma-Aldrich | V9264 | |
| DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratagene, Agilent Technologies | 715-485-150 | |
| TRITC-labelled phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
| cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche Group | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
| PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G/0650/17 | |
| Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
| NaCl | Fisher Scientific | S/0160/65 | |
| NP40 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
References
- Bass, M. D. A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis. Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).
- Echtermeyer, F. Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4. J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).
- Bass, M. D. Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix. J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).
- Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments. Embo. J. 5, 665-670 (1986).
- Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1. J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).
- Claes, L., Willie, B. The enhancement of bone regeneration by ultrasound. Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).
- Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound. J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).
- Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study. J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).
- Danen, E. H. Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1. J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).
- Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).
- Makarem, R. Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1. J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).
