Qui, dettaglio una metodologia per l'isolamento rapido delle cellule dendritiche di topo intestinali (DCS) e macrofagi. Caratterizzazione fenotipica di DC intestinali e macrofagi viene eseguita utilizzando multi-color analisi citometrica mentre magnetica arricchimento tallone seguita dalla selezione cellulare viene utilizzato per produrre le popolazioni di elevata purezza per gli studi funzionali.
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Articolo metodologico
Isolamento e caratterizzazione di cellule dendritiche ei macrofagi dall'intestino mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
All'interno l'intestino risiedono popolazioni uniche di cellule immunitarie innate e adattiva che sono coinvolti nella promozione della tolleranza verso la flora commensale e gli antigeni alimentari, mentre in concomitanza rimanendo in bilico per montare le risposte infiammatorie verso invasive 1,2 patogeni. Cellule presentanti l'antigene, in particolare DCS e macrofagi, giocano un ruolo critico nel mantenimento della omeostasi immunitaria intestinale attraverso la loro capacità di percepire e rispondere adeguatamente al microbiota 3-14. Isolamento efficiente di DC intestinali e macrofagi è un passo fondamentale nel caratterizzare il fenotipo e la funzione di queste cellule. Mentre molti metodi efficaci per isolare cellule immunitarie intestinali, compresi DC e macrofagi, sono stati descritti 6,10,15-24, contare su lunghe molte volte digestioni che possono influenzare negativamente l'espressione sulla superficie cellulare antigene, la vitalità cellulare, e / o quantità di cellule. Qui, si dettaglio una metodologia per l'isolamento rapido di un gran numero di viablelettronici, DCS intestinali e macrofagi. Caratterizzazione fenotipica delle DC intestinali e macrofagi viene effettuata direttamente colorazione cellule intestinali isolate con specifici anticorpi monoclonali marcati a fluorescenza per multi-colore analisi citofluorimetrica. Inoltre, DC altamente puro e popolazioni macrofagi sono isolati per studi funzionali utilizzano CD11c e CD11b magnetico attivati perline di separazione delle cellule seguite da selezione cellulare.
Protocollo
1. Dissezione e la dissociazione di cellule epiteliali intestinali
Preparazione dei reagenti e attrezzature:
- Caldo Ca 2 + / Mg 2 +-libera PBS (CMF PBS) a temperatura ambiente.
- Caldo Ca 2 + / Mg 2 +-libere HBSS con 5% FBS (CMF HBSS / FBS) e 2 mM EDTA a temperatura ambiente.
- Warm Agitatore orbitale a 37 ° C.
Nota: Procedura 1,1 a 1,7 devono essere eseguite più rapidamente possibile per minimizzare l'entità della morte cellulare e per ottenere la massima resa cella.
- Euthanize topi in una camera di CO....
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Discussione
Figura 3. Fattori importanti per l'ottimizzazione della resa delle cellule e l'espressione dell'antigene di superficie. Resa cellulare e l'espressione dell'antigene di superficie sono direttamente interessati dalla durata della digestione dei tessuti, le caratteristiche specifiche del collagenasi, il grado di macinazione dei tessuti e la presenza o l'assenza di infiammazione, che possano pregiudicare l'integ.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo Aaron Rae (Emory University Dipartimento di Pediatria e Healthcare bambini di Core flusso Atlanta) per l'ordinamento delle cellule. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH AA01787001, un Career Development Award dal morbo di Crohn e Colite Foundation of America, e della ricerca uno Emory-Egleston Children Center di sementi sovvenzione TLD
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| 1X PBS, Ca 2 + - 2 + e Mg-free | |||
| Sale di Hank soluzione equilibrata (HBSS) con rosso fenolo | Fisher Scientific | SH3001603 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma | S6014 | |
| HEPES 1M in 0,85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| Siero bovino fetale (FBS) | Atlanta biologici | S11150H | Inattivato al calore |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenase di tipo VIII | Sigma | C2139 | |
| DNasi I | Roche | 14785000 | Soluzione madre: 100mg/ml |
| LIVE / DEAD fissabile Aqua Kit Dead Cell Stain per 405 nm di eccitazione | Invitrogen | L34957 | Utilizzare a 1:1000 |
| CD45-PerCP mAb (30F11) | BD | 557235 | Utilizzare a 1:100 |
| CD103-PE mAb (M290) | BD | 557495 | Utilizzare a 1:100 |
| FcyRIII / II mAb (2.4G2) | BD | 553141 | Utilizzare a 1:200 |
| CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Utilizzare a 1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Utilizzare a 1:100 |
| CD11b-eFluor 450mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Utilizzare a 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microsfere | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| CD11c microsfere | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| 50 ml provette coniche | BD Falcon | 352098 | |
| Singola mesh filo | Chefmate | ||
| Piccola pesano barca | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
| Filtro da 100 micron delle cellule | BD Falcon | 352360 | |
| 40 micron filtro cella | BD Falcon | 352340 | |
| 5 ml in polistirolo a fondo tondo tubi | BD Falcon | 352235 | Utilizzare a 1:100 |
| MaxQ 4450 agitatore orbitale da banco | Thermo Scientific | ||
| LS MACS colonna | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSR II | BD | ||
| FACSAria II | BD |
Riferimenti
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity. Trends Immu....
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Ristampe e permessi
