Liofilizzazione è spesso un modo semplice e conveniente per ottenere prodotti a secco di cellule batteriche vitali. Un problema del processo è la sopravvivenza delle cellule. Abbiamo dettaglio qui una procedura per indagare come sopravvivenza cellulare durante la liofilizzazione è influenzata dalle proprietà della formulazione utilizzata.
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Articolo metodologico
Formulazioni per la liofilizzazione di batteri e la loro influenza sulla sopravvivenza cellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Acqua cellulare può essere rimosso per inattivare microrganismi reversibilmente esigenze di stoccaggio. Uno di questi metodi di rimozione è liofilizzazione, che è considerato un metodo di disidratazione delicato. Per facilitare la sopravvivenza cellulare durante l'asciugatura, le cellule sono spesso formulate in anticipo. La formulazione forma una matrice che incorpora le cellule e le protegge da varie sollecitazioni dannose imposte alle cellule durante il congelamento e l'essiccazione. Presentiamo qui un metodo generale per valutare il tasso di sopravvivenza delle cellule dopo liofilizzazione e illustriamo lo confrontando i risultati ottenuti con quattro diverse formulazioni: disaccaride saccarosio, il saccarosio derivato polimero Ficoll PM400, e le rispettive polisaccaridi idrossietilcellulosa (HEC ) e idrossipropilmetilcellulosa (HPMC), su due ceppi di batteri, P. putida KT2440 e A. A6 chlorophenolicus. In questo lavoro si illustra come preparare formulazioni per la liofilizzazione e il modo di indagare la meccanicaismi della sopravvivenza cellulare dopo la reidratazione caratterizzando la formulazione di usando calorimetria a scansione differenziale (DSC), misure di tensione superficiale, analisi a raggi X e microscopia elettronica e tali dati relativi ai tassi di sopravvivenza. I polimeri sono stati scelti per ottenere una struttura monomerica del rispettivo saccarosio polisaccaride simile ad una misura diversa. Usando questa configurazione metodo abbiamo dimostrato che polimeri possono supportare la sopravvivenza cellulare nel modo più efficace disaccaridi se certe proprietà fisiche della formulazione sono controllate 1.
Protocollo
1. Coltivazione e raccolta di P. putida
- Preparare una coltura di Pseudomonas putida inoculando 100 ml di brodo di soia trittico (TSB) con una colonia di P. cellule putida coltivati su agar addizionato con trittico brodo di soia (TSA). Mantenere la coltura a 30 ° C su una tavola oscillante impostata a 130 rpm.
- Dopo 7 ore trasferire un'aliquota dal coltura starter equivalente a 1/10 del volume finale della coltura principale per fresco TSB-medium. Mantenere le cellule a 30 ° C su un bordo di agitazione a 130 rpm per 16 ore.
- Dopo 16 ore di crescita le cellule vengono raccolte a girare la coltura ce....
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Risultati
Tabella 1 mostra i dati sulla composizione formulazione, eventi termici registrati dalla DSC durante il riscaldamento delle formulazioni congelati, la struttura dei campioni secco e la tensione superficiale delle soluzioni di formulazione. La T g 'di saccarosio sia stata determinata a -40 ° C 2, 3 e può essere difficile da rilevare per le concentrazioni di saccarosio inferiore al 20% w / w. L'evento termico a -35 ° C è probabilmente correlato alla comparsa di ghiac.......
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Discussione
Il motivo di questo studio era di studiare alcune proprietà di formulazione che possono essere di importanza per la sopravvivenza delle cellule durante la liofilizzazione. Sebbene la tolleranza asciugatura intrinseco varia tra specie diverse, come illustrato nella Figura 1A, la tendenza da quanto la formulazioni differente supporto sopravvivenza cellulare è simile. È istruttivo per iniziare con un confronto di saccarosio e di Ficoll. Si ritiene che un fattore chiave per una formulazione per supportare l.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Svedese per la Ricerca Ambientale Strategica (MISTRA) attraverso il programma di DOM e Grant 211684 (BACSIN) dal programma quadro della Comunità europea del 7 ° PQ. Ringraziamo J. Engstrand per l'assistenza a filmare l'analisi a raggi X e L. Tang per aiutare con la narrazione concettuale.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ficoll PM 400 | GE-healthcare | 17-0300-10 | |
| HEC (Natrosol-M Pharm Grade) | Ashland | Dono da Ashland | |
| HPMC (Methocel F4M) | Dow | Dono dal Dipartimento di Farmacia, Università di Uppsala | |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S2395 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| Brodo Tryptic Soy | Merck | 105459 | |
| Agar Tryptic Soy | Merck | 105458 | |
| Lyostar II | FTS Kinetics | N.A. | |
| Pyris Diamond DSC | Perkin-Elmer | N.A. | |
| Diffrattometro Bruker AXS SMART CCD 1k | Bruker | N.A | |
| FIB/SEM a doppio fascio FEI Strata DB235 | FEI | N.A | |
| Tensiometro didattico Krüss | Krüss | N.A. |
Riferimenti
- Wessman, P., Mahlin, D., et al. Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria. J. Sci. Food Agric. 91 (14), 2518-2528 (2011).
- Ablett, S., Izzard, M. J., et al. Differential Scanning....
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