Formulazioni per la liofilizzazione di batteri e la loro influenza sulla sopravvivenza cellulare

Summary

Liofilizzazione è spesso un modo semplice e conveniente per ottenere prodotti a secco di cellule batteriche vitali. Un problema del processo è la sopravvivenza delle cellule. Abbiamo dettaglio qui una procedura per indagare come sopravvivenza cellulare durante la liofilizzazione è influenzata dalle proprietà della formulazione utilizzata.

Abstract

Acqua cellulare può essere rimosso per inattivare microrganismi reversibilmente esigenze di stoccaggio. Uno di questi metodi di rimozione è liofilizzazione, che è considerato un metodo di disidratazione delicato. Per facilitare la sopravvivenza cellulare durante l'asciugatura, le cellule sono spesso formulate in anticipo. La formulazione forma una matrice che incorpora le cellule e le protegge da varie sollecitazioni dannose imposte alle cellule durante il congelamento e l'essiccazione. Presentiamo qui un metodo generale per valutare il tasso di sopravvivenza delle cellule dopo liofilizzazione e illustriamo lo confrontando i risultati ottenuti con quattro diverse formulazioni: disaccaride saccarosio, il saccarosio derivato polimero Ficoll PM400, e le rispettive polisaccaridi idrossietilcellulosa (HEC ) e idrossipropilmetilcellulosa (HPMC), su due ceppi di batteri, P. putida KT2440 e A. A6 chlorophenolicus. In questo lavoro si illustra come preparare formulazioni per la liofilizzazione e il modo di indagare la meccanicaismi della sopravvivenza cellulare dopo la reidratazione caratterizzando la formulazione di usando calorimetria a scansione differenziale (DSC), misure di tensione superficiale, analisi a raggi X e microscopia elettronica e tali dati relativi ai tassi di sopravvivenza. I polimeri sono stati scelti per ottenere una struttura monomerica del rispettivo saccarosio polisaccaride simile ad una misura diversa. Usando questa configurazione metodo abbiamo dimostrato che polimeri possono supportare la sopravvivenza cellulare nel modo più efficace disaccaridi se certe proprietà fisiche della formulazione sono controllate ^1.

Protocol

1. Coltivazione e raccolta di P. putida

1. Preparare una coltura di Pseudomonas putida inoculando 100 ml di brodo di soia trittico (TSB) con una colonia di P. cellule putida coltivati ​​su agar addizionato con trittico brodo di soia (TSA). Mantenere la coltura a 30 ° C su una tavola oscillante impostata a 130 rpm.
2. Dopo 7 ore trasferire un'aliquota dal coltura starter equivalente a 1/10 del volume finale della coltura principale per fresco TSB-medium. Mantenere le cellule a 30 ° C su un bordo di agitazione a 130 rpm per 16 ore.
3. Dopo 16 ore di crescita le cellule vengono raccolte a girare la coltura cellulare a 1500 xg per 20 minuti a temperatura ambiente. Decantare il surnatante e lavare le cellule da ri-sospende il pellet cellulare è in una soluzione di NaCl che è isotonica al mezzo di crescita. In questo caso è stata utilizzata una soluzione 150 mM di NaCl. Le cellule vengono quindi centrifugate nuovamente e il supernatante viene decantato prima di risospendere le cellule nel mezzo formulazione,vedere il punto 3.2.

2. La coltivazione di altre specie

1. Per adattare il protocollo ad altre specie batteriche le procedure di coltivazione e di raccolta dovrebbero essere modificati in base alle esigenze di quella specie. Per evitare shock osmotico durante la manipolazione delle cellule durante la vendemmia e la fase di lavaggio (s), l'osmolalità delle soluzioni deve corrispondere a quella del mezzo di crescita al momento della raccolta.

3. Formulazione di cellule

1. Preparare le soluzioni di formulazione pesando i rispettivi componenti della matrice e si sciolgono in acqua. Di ottenere condizioni isotoniche, sia regolare la quantità di eccipiente o aggiungere NaCl o qualche altro soluto compatibile cella per raggiungere la osmolalità desiderato. Per le sostanze a basso peso molecolare, come disaccaridi gli importi possono essere facilmente regolati per raggiungere le condizioni isotoniche. Per sostanze come polimeri che sono di alto peso molecolare, la tonicità deve essere regolata con la cellula in modo compatibileliuti, ad esempio NaCl o disaccaridi. Si noti che l'eventuale aggiunta di una sostanza influenza le proprietà fisiche della formulazione, che a loro volta possono influenzare il comportamento liofilizzazione e la sopravvivenza cellulare.
2. Decantare la soluzione di lavaggio (in questo caso NaCl) e risospendere le cellule in rispettivi mezzi di formulazione.
3. Assicurarsi che le cellule sono omogeneamente dispersi. Formulazioni di bassa viscosità sono in agitazione mentre formulazioni di viscosità più elevate sono mescolati con l'aggiunta, per esempio., Un ancoretta e scuotendo il contenitore fino a miscelazione omogenea si ottiene.
4. Dividete le formulazioni in fiale liofilizzatore. I flaconcini devono essere pesate vuote, con il campione prima e dopo liofilizzazione per calcolare la quantità di acqua rimossa durante la liofilizzazione.
5. Aggiungi ai tappi di gomma dei flaconcini se le fiale devono essere sigillate all'interno del liofilizzatore, vedere il punto 4.3.
6. Enumerare le cellule in ogni formulazione prima della liofilizzazione, vedi punto 6.
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4. Liofilizzazione

1. Le condizioni di liofilizzazione devono essere adattati alle proprietà fisiche della formulazione. Il parametro più importante è in questo caso la temperatura di transizione vetrosa, Tg, della formulazione, denotato Tg 'per il campione freeze-concentrato per indicare che l'acqua è ancora presente. Il Tg 'della formulazione freeze-concentrato è facilmente misurata con la calorimetria differenziale a scansione (DSC), vedere punto 7.
2. Regolare i parametri del processo di liofilizzazione modo che la temperatura del campione è sempre inferiore alla Tg del campione e che la pressione in camera consente un rapido sublimazione del ghiaccio, cioè essiccazione primarie, e l'acqua residua nella formulazione, cioè secondaria essiccazione. Se la temperatura del campione è superiore Tg 'durante il processo di essiccazione è un grande rischio di collasso strutturale del campione che può diminuire significativamente la sopravvivenza cellulare.
3. Per proteggere i prodotti secchi dopo freeze-essiccazione l'atmosfera campione deve essere controllato. Se possibile, sigillare i campioni nel liofilizzatore prima che il vuoto viene rilasciato alla fine del ciclo di liofilizzazione. In alternativa, i flaconi possono essere riempiti con un'atmosfera preferito. È importante evitare di esporre i campioni alle condizioni ambientali di umidità o ossigeno presente nell'atmosfera stoccaggio influenzerà la sopravvivenza delle cellule.
4. Pesare le fiale.

5. Reidratazione

1. Reidratare i campioni con acqua deionizzata e sterile. La quantità di acqua da aggiungere che dovrebbe essere uguale alla quantità rimossa durante la liofilizzazione e viene calcolato dal peso del flacone vuoto, lo stesso flaconcino con campione prima e dopo la liofilizzazione. Vortex i campioni di oggi e di nuovo poi fino a quando le soluzioni appaiono omogenee.

6. Enumerazione

1. Disegna 100 microlitri di ciascun campione e fare diluizioni seriali di 10 volte. Dalle diluizioni di interiposo 100 microlitri è placcato su TSA-piastre. Le piastre vengono incubate a temperatura e tempo richiesto.

7. Caratterizzazione di Formulazione di comportamento di blocco

1. Prendete una piccola quantità, 5 - 10 mg, del campione e racchiuderlo in una padella DSC-alluminio con coperchio. Preparare una pentola vuota come riferimento.
2. Impostare il programma di scansione di temperatura DSC. Il programma di raffreddamento è impostato per imitare il passo congelamento nel programma liofilizzazione. Questo viene fatto come la cinetica di raffreddamento possono influenzare la Tg 'delle formulazioni idrati. Prima della scansione riscaldamento inizia abbattere la temperatura al di sotto della Tg atteso 'delle formulazioni indagate, normalmente -100 ° C.
3. Scegliere un tasso adeguato riscaldamento, normalmente una velocità di riscaldamento di 5 - 40 ° C è utilizzato / min. Il segnale di flusso di calore registrata è espresso in watt e verrà influenzata dalla velocità di riscaldamento. Un tasso di riscaldamento più alto darà un segnale maggiore di Tg '.
4. Impostare l'intervallo di temperatura in modo che it copre sia Tg 'e lo scioglimento della formulazione.

8. Tensione superficiale Misure delle formulazioni idrate

1. Il setup sperimentale utilizzato in questo esperimento è secondo il metodo per misurare du Noüy superficie.
2. Pulire l'anello di platino e il vaso di misura con attenzione. Il vaso viene risciacquata con acetone, si asciugò con un panno privo di pelucchi, e poi bruciato all'interno con una fiamma incolore. L'anello si illumina di rosso in una fiamma incolore.
3. Riempire il serbatoio con la soluzione e lasciare che la superficie di risolvere prima di misurare. Per le soluzioni in cui si raggiunge lo stato di equilibrio solo dopo un lungo periodo di tempo, ad esempio, i polimeri, la semplice impostazione adottata permette di fornire dati qualitativi.
4. Per le formulazioni con alte viscosità, ad esempio miscele di 2% (w / w) o HEC HPMC, la tensione superficiale deve essere misurata su soluzioni a concentrazioni inferiori e poi estrapolato. Questo può essere fatto sfruttando il fatto chela caduta dei livelli di tensione superficiale off in concentrazioni inferiori a 0,5% (w / w).

9. X-ray analisi delle formulazioni a secco

1. Prendere una piccola quantità di matrice / batteri e caricarla su un supporto del campione.
2. Montare il supporto del campione nella radiografia-diffrattometro.
3. Per analizzare qualsiasi fase cristallina presente nel campione pacchetto del programma EVA da Bruker può essere utilizzato.

10. Microscopia Elettronica

1. Prendere una piccola quantità di matrice / batteri fuori delle fiale e fissarlo su uno stub SEM.
2. Caricare il supporto di SEM in sputtering-verniciatore (Thermo Polaron VGScientific SC7640 utilizzato nel presente lavoro) e coprire il campione con pochi nm di Au / Pd o Pt. In questi esperimenti i parametri di sputtering sono stati: 1.900 V, 20 mA, e 20 sec, per un ~ 5-10 nm rivestimento Au / Pd. Il rivestimento si riduce la carica elettrica durante l'acquisizione dell'immagine. Si consiglia di iniziare con un rivestimento sottile e, se la carica persiste e provoca immagineartefatti, il campione devono essere rivestite di nuovo.
3. Caricare il supporto SEM nella camera SEM. Selezionare i parametri di imaging appropriate. Per lo strumento utilizzato nella Figura 2 (FEI Strata DB235) abbiamo usato 5 kV tensione di accelerazione, spotsize 3, una distanza di lavoro di 5 mm e il rivelatore di elettroni secondari.
4. Facoltativamente, è possibile utilizzare il Focused Ion Beam per tagliare le sezioni trasversali dei batteri incorporati nel polimero per rivelare ulteriori dettagli.

Representative Results

Tabella 1 mostra i dati sulla composizione formulazione, eventi termici registrati dalla DSC durante il riscaldamento delle formulazioni congelati, la struttura dei campioni secco e la tensione superficiale delle soluzioni di formulazione. La T _g 'di saccarosio sia stata determinata a -40 ° C ^{2, 3} e può essere difficile da rilevare per le concentrazioni di saccarosio inferiore al 20% w / w. L'evento termico a -35 ° C è probabilmente correlato alla comparsa di ghiaccio dissoluzione ^2. La struttura cristallina rilevato da raggi X nel HEC e campioni di HPMC e visto anche in SEM (Figura 2b e 2c) sovrappone alla normale forma di cristallo di NaCl.

La figura 1A mostra i dati di sopravvivenza per il P. Gram-negativi putida e la A. Gram-positivi chlorophenolicus formulati nelle diverse formulazioni a base di saccaridi. Notare che la tendenza quanto bene formulazioni supportano sopravvivenza cellulare è la stessa per both specie di batteri. Il grafico mostrato in figura 1B illustra la correlazione tra la sopravvivenza liofilizzazione e le tensioni superficiali delle formulazioni.

La figura 2 mostra SEM-immagini delle formulazioni secche. Per i quattro polimeri qui indicati, la matrice formata ha l'aspetto di "carta croccante": fogli lisci interconnessi, in cui i batteri sono inseriti e visualizzati come ondulazioni. Per Ficoll e saccarosio, i fogli sono circa 1 micron di spessore e di 10 - 20 micron di larghezza, con Ficoll avendo una superficie più liscia. HPMC e HEC formare fogli molto sottili, probabilmente a causa del fatto che la quantità di polimero è meno in queste formulazioni a base di cellulosa che negli altri (Tabella 1). Inoltre, sono stati osservati cristalli di sale per HEC e HPMC, con il quale mostra una maggiore quantità di precipitati sulla superficie delle lastre polimeriche. Batteri sono più facilmente visibili nelle formulazioni a base di cellulosa perché i fogli sono esimointeriore. In saccarosio e Ficoll, sono per lo più osservate come ondulazione delle superfici altrimenti lisce.

Composizione Formulazione	Eventi relativi alla temperatura rilevati in formulazioni congelati	Struttura della formulazione secca	Tensione superficiale di formulazioni non asciugati (mN m -1)
10% di saccarosio	insorgenza di scioglimento del ghiaccio, -35 ° C	saccarosio amorfo	72 ± 0,1
10% Ficoll, 150 mM NaCl	T g ', -22 ° C	Ficoll amorfo	68 ± 0,3
2% HEC, 150 mM NaCl	fusione eutettica di ghiaccio e NaCl, -28 ° C	amorfo HEC, NaCl cristallino	64 ± 0,6
2% HPMC, 150 mM NaCl	fusione eutettica di ghiaccio e NaCl, -27 ° C	52 ± 0.8

Tabella 1. La composizione delle diverse formulazioni e le proprietà delle formulazioni acquose o secca. Le concentrazioni di polimero della HEC e HPMC stati massimizzato per ottenere una copertura spessa matrice abbastanza dei batteri ma hanno ancora una soluzione praticabile per quanto riguarda la viscosità.

Figura 1. A) I tassi di sopravvivenza di liofilizzati P. putida (bianco) e A. chlorophenolicus (grigio) quando formulati in soluzioni basate sulla disaccaride saccarosio o polimeri Ficoll, HEC e HPMC, B) Correlazione tra la sopravvivenza cellulare dopo liofilizzazione e la tensione superficiale delle formulazioni non-secchi.

Figura 2. Immagini SEM di P. putida in quattro diverse formulazioni: a) saccarosio, b) Ficoll, c), HEC, d) HPMC. I batteri sono difficili da vedere in a) e b), in quanto il foglio di polimero sono abbastanza spessa e può avvolgere completamente i batteri, in c) e d), i batteri si presentano in maniera più evidente in superficie. In d), esse possono essere distinte dalla grande quantità di sale precipitati a causa della loro forma e contrasto, come appaiono come oblunghe, corpuscoli scuri.

Discussion

Il motivo di questo studio era di studiare alcune proprietà di formulazione che possono essere di importanza per la sopravvivenza delle cellule durante la liofilizzazione. Sebbene la tolleranza asciugatura intrinseco varia tra specie diverse, come illustrato nella Figura 1A, la tendenza da quanto la formulazioni differente supporto sopravvivenza cellulare è simile. È istruttivo per iniziare con un confronto di saccarosio e di Ficoll. Si ritiene che un fattore chiave per una formulazione per supportare la sopravvivenza delle cellule è la capacità del ingrediente di formula (s) per sostituire l'acqua durante la disidratazione, mantenendo così la struttura delle proteine ​​e delle membrane della cellula anche allo stato secco. Disaccaridi come il saccarosio, ma anche trealosio dimostrare questa proprietà, mentre i polimeri come l'amido di polisaccaride non fanno ^5,11. Polimeri sono considerate troppo grandi per interagire con i lipidi di membrana nello stesso modo come disaccaridi. Un'altra proprietà importante per il successo liofilizzarezione dei microrganismi è la capacità della matrice di supporto per vetrificare (IE. diventano solidi amorfi) durante la liofilizzazione. La struttura amorfa è benefico per la schermatura e mantenere cellule separate. Interessante notare che entrambi disaccaridi e polimeri prontamente vetrificano se la liofilizzazione viene eseguito accuratamente. I nostri risultati mostrano che sia il saccarosio e formulazioni a base Ficoll diventano amorfo dopo liofilizzazione, vedi Tabella 1, e la sopravvivenza delle cellule supporto ugualmente bene. Tuttavia, ci sono differenze significative tra i due saccaridi. In contrasto con saccarosio, la molecola è Ficoll, con un peso molecolare di 400 kDa, troppo grande per sostituire l'acqua nelle interazioni con membrane lipidiche durante la liofilizzazione ^{4, 5.} Inoltre, come le molecole di Ficoll sono bloccate dallo spazio periplasmatico dei batteri Gram negativi, ancora una volta a causa della loro dimensione ^6, assorbimento cellulare di Ficoll è improbabile. Sulla base di questo, suggeriamo che l'effetto protettivo disposizioniata dalla formulazione saccarosio non è primariamente dovuta ad assorbimento cellulare del disaccaride, importante per le acque in sostituzione capacità delle strutture intracellulari ^{7, 8.} Piuttosto, la capacità di Ficoll per supportare la sopravvivenza cellulare ha a che fare con le proprietà comuni alla formulazione Ficoll e saccarosio, ad esempio la struttura amorfa.

Concentrandosi sui polimeri, è evidente dalla Figura 1A che la capacità delle formulazioni polimeriche per supportare la sopravvivenza cellulare varia. L'analisi ai raggi X ha mostrato che NaCl cristallizzato durante liofilizzazione e coesisteva con la struttura altrimenti amorfa delle formulazioni HEC e HPMC. Nessun materiale cristallino è stato rilevato nella formulazione a base di Ficoll. NaCl può formare complessi con le frazioni di carboidrati ossidrilici ^{9, 10.} In formulazioni Ficoll e HEC-based il NaCl di idrossile rapporto molare frazione era 1:11 e 01:01, rispettivamente, spiegando perché è stata rilevata alcuna cristallizzazionenella formulazione Ficoll-based. La separazione di fase tra NaCl ed i polimeri di cellulosa è stato osservato anche nelle DSC-investigazioni. Una fusione eutettica è stato registrato durante il riscaldamento del HEC congelati e HPMC-formulazioni che indica che la separazione di fase avviene allo stato congelato. La morfologia e la microstruttura della formulazione è rivelato dalla SEM di imaging (Figura 2) e la corrobora dati radiografici e DSC. Cellule batteriche sono visti sporgenti dai fogli con cristalli depositati NaCl chiaramente visibili sulla superficie delle HEC-sheets. Basato sulla somiglianza tra i tassi di sopravvivenza per i batteri formulate nelle soluzioni HEC-soluzione e Ficoll rispetto a HPMC concludiamo che lo stato del sale, sia come cristalli disperso o disciolto nel polimero, non correla con la sopravvivenza cellulare. Invece sopravvivenza cellulare mostra una relazione con la tensione superficiale delle formulazioni, vedere Figura 1B. Per basse tensioni superficiali, ltassi di sopravvivenza ower sono registrati per i batteri. Si noti tuttavia che la tensione superficiale misurata mostra l'interazione tra i soluti, cioè saccarosio ei polimeri, e la molecola di solvente. Ancora consente una speculazione che indiretta attività superficiale di polimeri può essere correlata alla loro tendenza ad interagire anche con le superfici cellulari in una maniera destabilizzante. Come la concentrazione dei soluti aumenta durante il congelamento, gli effetti negativi possono essere potenziati spiega perché l'effetto negativo dei polimeri tensioattivi non sono stati osservati quando solo la memorizzazione dei batteri contenuti nelle formulazioni idratanti completamente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.